研究背景:心搏骤停为急诊医学常见的急症之一,美国和加拿大急救医疗系统收治的心搏骤停发生率约为每年50-55/10万,其中约86%的患者接受了心肺复苏术,初步判断成功复苏的标志是自主循环恢复。心肺复苏术后的患者有25-50%能恢复自主循环,但神经功能恢复的患者仅2%-10%。心搏骤停后为全脑缺血状态,由于脑细胞对缺氧十分敏感,循环停止4-6min即可出现不可逆性脑损害和自主循环建立后的再灌注损伤。临床和基础研究一直在试图寻找能有效提高脑复苏质量的治疗方法或药物,虽然取得了一些肯定的结果,但仍缺乏真正改善脑复苏预后的治疗方案。因此,关于脑复苏的探索具有重大意义。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作为近年的研究热点,为复苏后脑功能的恢复开辟了一个新的前景。研究目的:将大鼠骨髓间充质干细胞通过尾静脉移植到心肺复苏后大鼠体内,观察间充质干细胞对全脑缺血缺氧损伤的改善作用,并证明骨髓间充质干细胞通过分泌IGF-1可能是使其获益的机制之一。研究方法:1.BMSCs尾静脉移植治疗心肺复苏后大鼠神经功能的研究(1)BMSCs的提取、培养以及鉴定取体重100-110g SPF级大鼠长骨骨髓作为供体来源,采用贴壁筛选法分离提纯BMSCs。取P3-4代细胞用于鉴定及移植。使用流式细胞仪法检测CD29、CD90、CD45、CD11b,移植前使用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转染标记BMSCs,冰冻切片观察海马组织内细胞定植情况。(2)窒息法诱导心搏骤停心肺复苏模型的建立随机将30只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组(sham组)、心搏骤停组(ca组),干细胞治疗组(bmscs组),每组各10只,采用窒息法诱导大鼠心脏骤停,rosc后1h经尾静脉输注bmscs,移植数量约为1×106。第3天,第7天为观察点,每个时间点各5只大鼠。(3)脑水含量测定及he染色观察病理变化分别于干预处理后的3d、7d处死大鼠,取大鼠海马组织制作切片,he染色。余脑组织经电子天平称重后,放入95℃恒温干燥箱烘烤72h至恒重后,再置于电子天平上精确称重。以百分率表示:含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。2.bmscs通过分泌igf-1改善心肺复苏后大鼠神经功能预后的研究(1)实验分组选择成年雄性sd大鼠,随机分为sham组(15只)、ca组(15只)、bmscs组(18只),同样采用窒息法诱导心脏骤停模型,rosc后1天、3天、7天为观察点。bmscs组各时间点为6只大鼠,其余组各时间点为5只。(2)行为功能评分、rt-pcr及免疫组化法测定igf-1的表达每组大鼠建立模型后1d、3d、7d采用改良mnss评分评价神经功能,并通过rt-pcr和免疫组织化学法检测胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor-1,igf-1)的表达量,并采用gfp/igf-1双标记荧光显示bmscs表达igf-1.(3)血清s100b水平检测rosc后经大鼠心脏抽血5ml,离心后采用elisa检测s100b水平。结果:1.bmscs培养24h后可见少量细胞贴壁,培养至第3天可见稀疏条索状细胞呈集落聚集,培养5-6天细胞增殖明显,相互紧密贴合,第7-9天可见细胞融合80%-90%,此时可进行第一次传代。此后每间隔4天传代一次。取p3代bmscs经流式细胞仪检测,表达cd29、cd90阳性率为97.15%、99.02%,表达cd45、cd11b阳性率为0.36%、1.45%。证明经过贴壁法分离、培养、传代所获得的bmscs纯度高,可用于下一步的移植实验。2.经窒息法诱导心脏骤停后,采用胸外心脏按压、机械辅助通气,肾上腺素强心等抢救措施后,平均动脉压维持60mmhg以上10min为自主循环恢复(restorationofspontaneouscirculation,rosc),提示模型制作成功。3.移植后1d、3d、7d均可在荧光显微镜下看到gfp标记的bmscs归巢于大鼠海马组织。4.CA组均比sham组及BMSCs治疗组脑水含量明显增加(均p<0.05)。HE染色提示BMSCs移植治疗可减轻心搏骤停后脑组织缺血缺氧性损伤。BMSCs治疗组神经细胞变性、坏死数量明显减少,程度减轻。5.通过改良mNSS神经功能学评分结果显示,复苏后1d、3d、7d CA组评分均明显高于sham组,结果具有统计学意义(均p<0.05),BMSCs治疗组评分明显低于CA组,结果具有统计学意义(均p<0.05),但7d时BMSCs组评分与sham组比较无明显差异(p>0.05)。6.实时定量RT-PCR结果证实BMSCs治疗组IGF-1 mRNA相对含量均高于sham组和CA组的相应时间点,结果具有统计学意义(均p<0.05)。GFP/IGF-1双标记荧光显示海马组织可见BMSCs表达IGF-1。免疫组化结果表明移植组可见海马组织IGF-1表达阳性,CA组仅有少量表达,两组表达量均高于sham组(p<0.05)。7.ROSC后各时间点,CA组、BMSCs治疗组较sham组血清S100B水平均明显上升(p<0.05)。BMSCs治疗组各时间点较CA组S100B水平均有明显的下降,结果具有统计学意义(均p<0.05)。结论:1.经组织贴壁法在体外分离、纯化的大鼠BMSCs纯度高,可用于细胞移植。2.BMSCs移植入大鼠体内后,可通过血脑屏障,并定植于海马损伤部位,减轻心脏骤停导致的全脑缺血缺氧损伤,促进神经功能的恢复。3.BMSCs治疗后可能通过促进自身IGF-1分泌,以减缓细胞凋亡,促进脑功能复苏,说明BMSCs通过分泌IGF-1修复神经损伤是其神经保护作用的可能机制之一。