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A43蛋白是酵母RNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)特有的一个亚基,由RPA43基因编码,能与转录因子Rm3相互作用,将polⅠ带到rDNA启动子上,从而起始转录。A43亚基是polⅠ中各亚基组装及polⅠ-Rrn3复合物稳定性的决定物质。A43蛋白有两个结构域,N-端RNP结构域(RNAP_Ⅰ_Rpa43_N)和C.端寡核苷酸(OB)结合结构域。迄今在哺乳动物、禽类及两栖类中发现了一个只含有A43蛋白N-端结构域的蛋白,Twist Neighbor(TWISTNB)蛋白,其编码基因的突变可导致患者学习能力障碍,可能为一种新型微缺失综合症。目前尚未见有该蛋白在昆虫中的相关报道。
从本实验室构建的家蚕cDNA文库中筛选到一个基因序列,其开放阅读框(ORF)为630 bp,编码209个氨基酸残基,预测蛋白分子量为23.77 kD。通过生物信息学分析,发现该基因编码的蛋白与其他物种中相关蛋白的同源性很低,却含有RNAP_Ⅰ_Rpa43_N保守结构域,故将其命名为BmRPA43 N(Bombyx mori RPA43_N),基因登录号为:GU288816。将BmRPA43 N基因克隆到表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点上,成功构建了融合蛋白表达质粒pET-28a(+)-BmRPA43 N。该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,SDS-PAGE结果显示,在预期位置有一特异性蛋白条带,且该融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有存在。对经Ni2+亲和层析柱纯化的蛋白进行FPLC反相柱分析,测得其纯度在90％以上;质谱鉴定该融合蛋白的分子量与理论值非常相近,说明BmRPA43 N基因表达成功。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫雄性新西兰兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测得其效价在1:12800以上,Western blotting检测表明抗体的特异性良好。运用Westernblotting和实时荧光定量PCR技术,发现BmRPA43 N在不同发育阶段转录和表达水平差异较大,其中表达量卵期最高,蛾期最低;而在五龄幼虫不同组织中则为血液中最高,脂肪体中最低。亚细胞定位分析结果显示,BmRPA43_N蛋白主要分布在细胞质中。根据本文实验获得的结果,推测BmRPA43_N在家蚕的生殖发育过程中具有十分重要的作用,其具体功能有待进一步研究。