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目的:培养SD大鼠星形胶质细胞和神经元并建立氧糖剥夺/复氧损伤神经元模型;研究浅低温（33℃）对星形胶质细胞线粒体通过隧道纳米管（TNTs）向OGD/R受损神经元转移的影响。方法:1.培养星形胶质细胞并建立OGD/R损伤神经元模型。取24h内新生SD乳鼠大脑皮层培养原代星形胶质细胞及神经元。采用三气（94%N2+5%CO2+1%O2）培养箱,联合无糖DMEM培养基处理成熟神经元建立OGD/R损伤神经元模型,氧糖剥夺（OGD）1h,继而复氧复糖24h。利用光镜、CCK-8试剂盒、硫堇染色以及Hoechst-PI染色对OGD/R损伤神经元模型进行评估。2.星形胶质细胞-神经元混合培养。将纯化后的星形胶质细胞传至六孔板,待长至80%后,消化离心加入神经元培养基吹打均匀后移入OGD/R受损神经元培养板中。3.观察常温下各种神经细胞间TNTs。（1）正常星形胶质细胞（A）组:传代后成熟的星形胶质细胞于常温条件下培养24h。（2）正常（N）组:正常培养的神经元于常温条件下培养24h。（3）损伤（OGD/R）组:神经元细胞1h OGD损伤后于常温条件下培养24h。（4）常温正常（A+N）组:正常培养的神经元与星形胶质细胞1:1常温条件下培养24h。（5）常温损伤（A+OGD/R）组:神经元细胞1h OGD处理后与星形胶质细胞以1:1于常温下培养24h。荧光显微镜观察各组细胞间是否形成TNTs及形成TNTs的数量。4.神经元氧糖剥夺/复氧对形成TNTs数量及星形胶质细胞线粒体向神经元转移数量的影响。（1）常温正常（A+N）组:正常培养的神经元与星形胶质细胞1:1常温条件下培养24h。（2）常温损伤（A+OGD/R）组:神经元细胞OGD1h处理后与星形胶质细胞1:1于常温下培养24h。荧光显微镜观察各组细胞间形成TNTs的数量及线粒体转移数量。5.神经元氧糖剥夺/复氧对星形胶质细胞与神经元混合培养后神经元线粒体膜电位、死亡率以及损伤的影响。（1）对照（Ctrl）组:正常神经元。（2）损伤（OGD/R）组:神经元细胞OGD 1h处理后于常温条件下培养24h。（3）常温正常（A+N）组:正常培养的神经元与星形胶质细胞1:1于常温下培养24h。（4）常温损伤（A+OGD/R）组:神经元OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1于常温下培养24h。观察各组神经元线粒体膜电位、死亡率以及损伤的情况。6.TNTs对转移到OGD/R受损神经元中星形胶质细胞线粒体数量的影响。（1）常温损伤（A+OGD/R）组:神经元OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1于常温下培养24h。（2）常温损伤Cyto D（A+OGD/R+Cyto D）组:神经元OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1并加入细胞松弛素D于常温下培养24h。在光镜和荧光显微镜下观察加入细胞松弛素D后星形胶质细胞形态及TNTs形成情况;荧光显微镜观察各组神经元内来自星形胶质细胞的线粒体数量。7.浅低温对星形胶质细胞线粒体经TNTs转移到OGD/R受损神经元的影响。7.1浅低温对星形胶质细胞与OGD/R受损神经元间TNTs形成及转移入受损神经元中星形胶质细胞线粒体数量的影响。（1）常温损伤（A+OGD/R）组:神经元细胞OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1常温下复氧复糖24h。（2）浅低温损伤（HA+OGD/R）组:神经元细胞OGD 1h处理后与星形胶质细胞浅低温条件下培养24h。荧光显微镜观察各组星形胶质细胞与神经元间形成的TNTs数量及转移入受损神经元中星形胶质细胞线粒体的数量。7.2浅低温对线粒体从星形胶质细胞经TNTs向OGD/R受损神经元转移的数量以及神经元线粒体膜电位的影响。（1）常温损伤（A+OGD/R）组:神经元OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1于常温下培养24h。（2）常温损伤Cyto D（A+OGD/R+Cyto D）组:神经元OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1并加入细胞松弛素D于常温下培养24h。（3）浅低温损伤（HA+OGD/R）组:神经元细胞OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1于浅低温条件下培养24h。（4）浅低温损伤Cyto D（A+OGD/R+Cyto D）组:神经元细胞OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1并加入细胞松弛素D于浅低温条件下培养24h。星形胶质细胞线粒体用Mito Tracker Red CMx Ros染色,CFSE对神经元进行染色标记,用荧光显微镜观察各组神经元中来自星形胶质细胞的线粒体。JC-1试剂盒检测各组神经元线粒体膜电位。7.3浅低温对星形胶质细胞线粒体经TNTs转移到OGD/R受损神经元后对受损神经元死亡率以及损伤情况的影响。（1）常温损伤（A+OGD/R）组:神经元细胞OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1于常温下培养24h。（2）常温损伤Cyto D（A+OGD/R+Cyto D）组:神经元细胞OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1并加入细胞松弛素D于常温下培养24h。（3）浅低温损伤（HA+OGD/R）组:神经元细胞OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1于浅低温条件下培养24h。（4）浅低温损伤Cyto D（A+OGD/R+Cyto D）组:神经元细胞OGD 1h处理后与星形胶质细胞1:1并加入细胞松弛素D于浅低温条件下培养24h。神经元的死亡率由Hoechst-PI染色检测。神经元的损伤情况由硫堇染色检测。结果:1.OGD/R损伤神经元模型建立成功。2.SD大鼠皮层培养的星形胶质细胞间、正常神经元间以及OGD/R受损神经元间、星形胶质细胞和正常神经元间、星形胶质细胞和OGD/R受损神经元间均存在TNTs。3.与A+N组相比,A+OGD/R组中的神经元内来自星形胶质细胞的线粒体数量增加,TNTs形成数量增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。4.与Ctrl组相比,OGD/R组和A+OGD/R组神经元线粒体膜电位降低,神经元死亡增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;神经元尼氏体数量减少,染色变浅,损伤增加;A+N组线粒体膜电位、死亡数量以及凋亡无明显变化。与OGD/R组相比,A+OGD/R组中神经元线粒体膜电位升高,神经元死亡减少（P＜0.05）;神经元尼氏体数量增加,染色较深,损伤减轻。5.光镜和荧光显微镜下观察到加入细胞松弛素D后,星形胶质细胞胞体呈圆形,未伸出突起,也未能与神经元间形成TNTs。与A+OGD/R+Cyto D组相比,A+OGD/R组中的神经元内来自星形胶质细胞的线粒体数量增加（P＜0.05）。6.与常温组相比,浅低温组星形胶质细胞和OGD/R受损神经元间形成的TNTs数量及星形胶质细胞线粒体转移入OGD/R受损神经元的数量明显增加（P＜0.05）。7.与常温组神经元组相比,浅低温组星形胶质细胞线粒体转移入OGD/R受损神经元的数量及线粒体膜电位有所增加。与加入细胞松弛素D组相比,未加细胞松弛素D组的星形胶质细胞线粒体转移入OGD/R受损神经元的数量及线粒体膜电位有所增加（P＜0.05）。8.与常温组神经元组相比,浅低温组OGD/R受损神经元死亡细胞减少（P＜0.05）;同时OGD/R受损神经元尼氏体数量增加,染色较深,突起碎裂减少。与加入细胞松弛素D组相比,未加细胞松弛素D组的OGD/R受损神经元死亡细胞减少（P＜0.05）;同时OGD/R受损神经元尼氏体数量增加,染色较深,突起碎裂减少。结论:1.常温条件下神经细胞间存在TNTs;神经元经受氧糖剥夺/复氧损伤后,与星形胶质细胞之间形成的TNTs增多,启动内源性神经保护作用。2.浅低温促进星形胶质细胞与OGD/R受损神经元间形成TNTs,增加功能性线粒体从星形胶质细胞向OGD/R受损神经元转移,加强内源性神经保护作用。