MAPK家族在异氟烷大鼠心肌预处理延迟相保护中的作用及机制前言心肌缺血预处理（ischemic preconditioning，IPC）有强大心肌保护作用，但其临床应用受诸多因素限制。药物预处理不但能起到与IPC相同或相似的心肌保护效果，而且在实践上方便、易控、相对安全，因此更受临床重视。挥发性麻醉药不仅有早期相心肌保护作用，且在大鼠、兔等动物证实有延迟相心肌保护效果。对其机制的研究涉及一氧化氮（NO）、活性氧簇（ROS）、K_ATP通道、G蛋白藕联受体、蛋白激酶C、蛋白酪氨酸激酶、丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）等多种物质及信号转导通路。研究发现MAPK参与了吸入麻醉药心肌预处理的早期相保护作用，其在延迟相保护作用中的角色尚未见文献报道。目的本实验采用Langendorff离体大鼠心脏灌注模型，内容共分两部分：第一部分研究不同浓度异氟烷延迟预处理（isoflurane induced delayed preconditioning，IsoP）对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响，探讨异氟烷延迟预处理的最适浓度和最佳间隔时间。第二部分观察ERK、p38MAPK、JNK在异氟烷预处理后缺血再灌注心肌的表达及作用，并应用ERK、p38MAPK、JNK特异性抑制剂观察其是否可拮抗或模拟异氟烷预处理效应；应用RT-PCR方法，观察三个激酶的下游底物c-fosmRNA、c-jun mRNA、HSP27 mRNA的含量变化，进一步探讨MAPK家族在异氟烷大鼠心肌预处理延迟相保护中的作用及机制。实验材料一、实验动物成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重250～300克，清洁级，雌雄不限。由徐州医学院实验动物中心提供。二、实验试剂氯化钙（AR） （徐州化学试剂二厂）葡萄糖（AR） （上海虹光化工厂）氯化钾（AR） （江苏第一化工厂）碳酸氢钠（AR） （上海虹光化工厂）氯化钠（AR） （上海虹光化工厂）磷酸二氢钾（AR） （上海化学试剂二厂）硫酸镁（AR） （连云港化学试剂厂）乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（AR）（南京化学试剂厂）异氟烷（美国雅培公司）TTC（氯化三苯基四氮唑）（Sigma公司）CK测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）LDH测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）p-JNK抗体（G-7）：sc-6254 （Santa Cruz Biotechnology, Inc）p-ERK抗体（E-4）：sc-7383 （Santa Cruz Biotechnology, Inc）p-p38MAPK抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc）JNK抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc）ERK抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc）p38MAPK抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc）经典总RNA抽提试剂盒（上海生物工程技术服务有限公司）BioRT逆转录扩增（RT-PCR）试剂盒（上海生物工程技术服务有限公司）c-fos、c-jun、HSP27引物（上海生工生物工程技术服务有限公司合成）三、实验器材Langendorff apparatus（美国）HL-4恒流泵（上海）UV-240PC紫外分光光度计（日本）光电分析天平（上海）BME-33血气分析仪（丹麦）SPECTRAMED血流动力学监测仪（美国）IVY 401监测仪（美国）HSS-1数字式超级恒温浴槽（成都）Varian 3400气相色谱仪（美国）NORMAC麻醉气体监测仪（荷兰）异氟烷蒸发罐（Muraco medical Co．ltd）Olympus AU 1000全自动生化分析仪（日本）Imagemaster VDS图像分析仪（美国）Maclab／4模数转换器（澳大利亚）Apple Macintosh 7200／90电脑（美国）RS-3200压力换能器（澳大利亚）CR-21高速冷冻离心机（日本）HARRIS超低温冰箱（美国）实验方法一、异氟烷延迟预处理对心肌缺血再灌注损伤的影响104只SD大鼠随机分为13组，每组8只。对照组（control）：大鼠不作任何处理，直接应用Langendorff罐注系统复制离体全心心肌缺血常温再灌注损伤模型，缺血30 min，再灌注120 min；吸氧预处理间隔24 h组（O₂24h）、吸氧预处理间隔48 h组（O₂48h）、吸氧预处理间隔72 h组（O₂72 h），此3组大鼠均先吸纯氧2 h；0.75MAC异氟烷预处理间隔24 h组（0.75Iso24 h）、0.75MAC异氟烷预处理间隔48 h组（0.75Iso48 h）、0.75MAC异氟烷预处理间隔72 h组（0.75Iso72 h），此3组大鼠均先吸入和氧气混合的0.75MAC异氟烷2 h；1.0MAC异氟烷预处理间隔24 h组（1.0Iso24 h）、1.0MAC异氟烷预处理间隔48 h组（1.0Iso48 h）、1.0MAC异氟烷预处理间隔72 h组（1.0Iso72 h），此3组大鼠吸入和氧气混合的1.0MAC异氟烷2 h；1.5MAC异氟烷预处理间隔24 h组（1.5Iso24 h）、1.5MAC异氟烷预处理间隔48 h组（1.5Iso48 h）、1.5MAC异氟烷预处理间隔72 h组（1.5Iso72 h），此3组大鼠吸入和氧气混合的1.5MAC异氟烷2 h；以上12组大鼠在预处理刺激结束后，均在空气浴箱中分别放养24 h、48 h、72 h后（肛温保持在37℃），应用Langendorff罐注系统复制离体全心心肌缺血常温再灌注损伤模型，缺血30min，再灌注120min。以Maclab／4s生理实验系统记录各组平衡末、缺血后即刻、再灌注后1min、3min、5min、10min、20min、30min、60min、90min、120min时左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室发展压（LVDP）、左室内压上升最大速率(+dp／dt_max)、左室内压下降最大速率(-dp／dt_max)、心率（HR）；化学法测定平衡末、再灌注后1min、5min、10min、20min、30min、60min、90min、120min时冠脉流出液中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）的释放量及用TTC染色法测定左心室心肌梗死面积。二、MAPK家族在异氟烷大鼠心肌预处理延迟相保护中的作用及机制根据第一部分的实验结果，发现1.5MAC异氟烷预处理间隔48h的心肌保护作用最好。56只大鼠随机分为7组，每组8只。对照组（control）、1.5MAC异氟烷预处理间隔48 h组（1.5Iso48 h）处置同第一部分。DMSO+1.5MAC异氟烷预处理间隔48h组（DM组）、PD98059+1.5MAC异氟烷预处理间隔48h组（PD组）、SB203580+1.5MAC异氟烷预处理间隔48h组（SB组）、SP600125+1.5MAC异氟烷预处理间隔48h组（SP+1.5Is048h组）、SP600125+control组（SP+con组），以上5组在缺血前45min分别腹腔注射10％DMSO 1ml、ERK抑制剂PD98059 0.5mg／kg、p38MAPK抑制剂SB203580 1mg／kg、JNK抑制剂SP600125 20mg／kg和SP60012520mg／kg。以后的模型制备、检测方法、检测指标同第一部分。另外，各组在再灌注末剪下左心室心尖部心肌组织，一部分作石蜡切片，免疫组织化学检测ERK、p38MAPK、JNK的磷酸化和核转位情况；一部分立即置于液氮中冷冻保存，westernblotting半定量分析ERK、p38MAPK、JNK的活性变化；RT-PCR法观察c-fosmRNA、c-jun mRNA、HSP27 mRNA的含量变化。实验结果第一部分各组平衡末及缺血后即刻的各种心功能指标均无显著差异（P>0.05）。异氟烷预处理各组复灌后各时间点的LVEDP均显著低于control组和O₂预处理组（P<0.05，P<0.01），再灌注3min、5min时，1.5Iso48h组LVEDP明显低于0.75Iso异氟烷预处理各组（P<0.05）；异氟烷预处理各组LVDP的恢复百分比均高于control组和O₂预处理组，其中复灌30min时，1.5Iso48h组LVDP的恢复百分比是63％，明显高于control组（39％）。1.0MAC异氟烷预处理各组和1.5MAC异氟烷预处理各组+dp／dt_max在复灌20min、30min、45min的恢复百分比高于control组（P<0.05，P<0.01）；1.5Iso48h组+dp／dt_max在复灌60min、90min、120min的恢复百分比仍明显高于control组（P<0.01），且在20min、30min、45min的恢复百分比高于O₂预处理组（P<0.05，P<0.01）；复灌30 min、45 min、60 min、90 min、120 min，1.5Iso48h组-dp／dt_max的恢复值显著高于control组、氧气预处理组、0.75MAC异氟烷预处理组（P<0.05，P<0.01）；并在复灌20 min、30 min时高于1.0Iso24h组（P<0.05），复灌20min时高于1.0Iso72h组（P<0.05）；1.5Iso48h组复灌20min、30min、45min、60min、90min、120min时的心率明显高于control组和O₂预处理组（P<0.05，P<0.01）；1.5Iso24h组、1.5Iso72h组、1.0Iso48h组、1.0Iso72h组复灌30min、45min的心率明显高于control组（P<0.05，P<0.01）；0.75MAC异氟烷预处理各组以上各指标的恢复均好于control组，但没有统计学意义。复灌后异氟烷预处理各组CK、LDH的释放量明显低于control组和O₂预处理组（P<0.05，P<0.01），复灌各时间点1.5IsO48h组CK的释放量明显低于O₂预处理组和0.75MAC异氟烷预处理组（P<0.05，P<0.01），并于复灌60min、90min、120min CK的释放量明显低于1.0Iso24h组和1.0Iso72h组（P<0.05，P<0.01）；1.5Iso48h组LDH的释放量在复灌5min、10min、20min、90min、120min明显低于0.75M异氟烷预处理组（P<0.05，P<0.01），复灌20min，明显低于1.0Iso24h组和1.5Iso24h组（P<0.05，P<0.01）；异氟烷预处理各组心肌梗死面积，均显著少于control组（P<0.05，P<0.01），1.5Iso48h组和1.0Iso48h组心肌梗死面积显著小于0.75M异氟烷预处理各组和O₂预处理各组（P<0.01）。第二部分1、ERK抑制剂PD98059组（PD组）与1.5Iso48h组比较，心功能各项指标均明显恶化，CK、LDH的释放量明显增加，心梗面积显著增加（P<0.05，P<0.01），PD98059部分逆转了异氟烷预处理的延迟相心肌保护效应。免疫组织化学染色显示：control组未见ERK磷酸化和核转位的阳性细胞，1.5Iso48h组ERK出现明显的活化特征，并发生核转位，表现为：棕褐色阳性颗粒较弥散地分布于心肌细胞胞浆和浓集于胞核。PD98059明显抑制了ERK磷酸化和核转位现象。Westernblot半定量分析显示1.5Iso48h组p-ERK1／2的表达量明显高于control组（P<0.01），PD98059显著抑制了p-ERK1／2的表达（P<0.01，versus 1.5Iso48h组）；RT-PCR结果显示：1.5Iso48h组c-fos mRNA含量显著升高（P<0.01，versus control组）；PD98059使c-fos mRNA含量显著减少（vs1.5Iso48h组，P<0.01）。2、p38MAPK抑制剂SB203580组（SB组）与1.5Iso48h组比较，心功能各项指标恢复比均显著降低，CK、LDH的释放量明显增加，心梗面积显著增加（P<0.05，P<0.01），SB203580部分逆转了异氟烷预处理的延迟相心肌保护效应。免疫组织化学染色显示：control组未见p38MAPK磷酸化和核转位的阳性细胞，1.5Iso48h组p38MAPK出现明显的活化特征，并发生核转位，表现为：棕褐色阳性颗粒较弥散地分布于心肌细胞胞浆和浓集于胞核。SB203580明显抑制了p38MAPK磷酸化和核转位现象。Westernblot半定量分析1.5Iso48h组p38MAPK的表达量明显高于control组（P<0.01），SB203580显著抑制了p-p38MAPK的表达（P<0.01，versus 1.5Iso48h组）；RT-PCR结果显示：1.5Iso48h组HSP27 mRNA含量显著升高（P<0.01，versus control组）；SB203580使HSP27 mRNA含量显著减少（vs1.5Iso48h组，P<0.01）。3、JNK抑制剂SP600125+1.5Iso48h组（SP+1.5Iso48h组）与1.5Iso48h组比较，心功能各项指标、CK、LDH的释放量、心梗面积均无显著变化（P>0.05）；免疫组织化学染色显示：control组可见JNK磷酸化和核转位的阳性细胞，1.5Iso48h组及SP+1.5Iso48h组明显抑制了JNK磷酸化。Westernblot半定量分析显示1.5Iso48h组及SP+1.5Iso48h组p-JNK1、p-JNK2的表达量明显低于control组（P<0.01）；RT-PCR结果显示：control组c-jun mPNA含量显著升高（P<0.01，versus 1.5Iso48h组及SP+1.5Iso48h组），SP+1.5Iso48h组c-jun mRNA含量较1.5Iso48h组进一步减少，且有显著统计学意义（P<0.01）。4、SP600125+control组（SP+con组）与control组比较，心功能各项指标恢复百分比增高，CK、LDH的释放量降低，心梗面积减少（P<0.05）；但对心肌保护作用弱于1.5Iso48h组和SP+1.5Iso48h组（P<0.05）；p-JNK1、p-JNK2的表达及c-jun mRNA含量明显低于control组（P<0.01），与1.5Iso48h组和SP+1.5Iso48h组比较无明显差异（P>0.05）。DMSO对各组上述指标未见明显影响。讨论Kersten等在1997年首次发现吸入麻醉药在心肌可诱导IPC（ischemicpreconditioning，IPC）样效应，称为麻醉药诱导的预处理（anesthetic inducedpreconditioning，APC）。氟烷、异氟烷、七氟烷和地氟烷均被证实有APC样作用，且也有早期相和晚期相（或延迟相）保护作用之分。早期相保护作用是吸入麻醉药预处理后数分钟即可发生，并持续2-3h。延迟相保护作用是预处理刺激后12-24h发生，并持续48-72h，因此更具临床意义。心肌预处理效应是在各种应激性因素刺激下心肌细胞内一系列事件级联反应的结果，可将此过程中的各种作用因素分为三类：触发因子（trigger）在预刺激的早期相产生，对预处理效应有始化作用（initiator）；介导因子（mediator）在预刺激后缺血再灌注期间产生，例如蛋白激酶等可以综合各种信号，并调节末端效应子。效应因子（effector）是产生预处理保护作用的终端物质。MAPK是一类高度保守的丝／苏氨酸蛋白激酶，是与细胞增殖、分化或凋亡密切相关的细胞内信号转导酶类，在哺乳类动物细胞中，主要有ERKs（extracellularsignal-regulated kinase）、JNKs／SAPKs（c-Jun NH₂-terminal kinase／stress-activatedprotein kinase）和p38 MAPK三种亚类，其上游激酶分别是Ras／Raf-MEK₁／MEK₂、MEKKs-MKK₄／MKK₇和MKK₃／MKK₆。引起ERK激活的细胞外信号主要是生长因子等有丝分裂刺激，导致细胞增殖、分化等核反应；缺血缺氧、应激、紫外线和细胞因子等多种胞外刺激主要激活p38MAPK和JNK通路，从而影响不同病理条件下细胞的生物学行为和组织器官的功能。研究普遍认为MAPKs在调节细胞的生存和凋亡过程中发挥关键作用。MAPK家族在IPC中的作用是预处理机制研究的重点内容之一，研究发现MAPK在IPC中发挥重要作用。MAPK在吸入麻醉药心肌预处理中的作用研究较少。Da Silva等在大鼠离体心肌模型上发现，异氟烷诱导的早期相心肌保护与IPC不同，在触发阶段不需要激活ERK1／2和P38MAPK。但是ERK1／2在缺血再灌注阶段被强烈激活，在缺血再灌注期持续应用ERK抑制剂PD98059可以取消异氟烷的保护作用，提示ERK1／2在APC中作为介导因子发挥作用。在兔和大鼠的实验模型上已发现吸入麻醉药预处理的第二窗保护效应，并显示ROS、环氧合酶-2、K_ATP通道等在其中发挥重要作用。MAPK家族在其中扮演何种角色文献未见报道。本研究应用离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型对异氟烷延迟预处理的心脏保护作用进行观察，发现1.5MAC异氟烷预处理间隔48h对心肌的保护作用最强，心肌功能指标的恢复、心肌酶的释放、心肌梗死面积的减少等均好于其它预处理组。免疫组织化学显示异氟烷预处理可以激活ERK和p38MAPK并使其核转位，还能抑制JNK的激活；缺血再灌注前应用PD98059和SB203580均能不同程度的逆转异氟烷预处理效应；SP600125能部分模拟预处理保护作用；提示异氟烷预处理的延迟相心脏保护作用可能是通过激活ERK和p38MAPK、抑制JNK的活性实现的。c-fos、c-jun、HSP27分别为ERK、JNK、p38MAPK的下游底物，RT-PCR结果显示：异氟烷预处理可引起c-fos mRNA、HSP27 mRNA表达上调，使c-jun mRNA表达下调；这三种基因含量的变化均可分别被三种激酶抑制剂所阻断。综上所述，ERK、JNK、p38MAPK共同参与异氟烷预处理的延迟相心脏保护效应，ERK、p38MAPK可能作为介导子参与异氟烷心肌延迟预处理的信号转导，抑制JNK激活可能也是异氟烷心肌延迟预处理的重要机制之一。c-fos、HSP27、c-jun可能是异氟烷心肌延迟预处理的末端效应子。异氟烷心肌延迟预处理可能通过激活ERK、p38MAPK及抑制JNK继而影响下游靶因子c-fos、HSP27、c-jun的转录，从而调控多种基因的表达和翻译，减轻心肌缺血再灌注损伤。结论本实验条件下得出如下结论：1、异氟烷预处理的延迟心脏保护作用是剂量依赖性的，且与间隔时间有关，1.5MAC异氟烷预处理间隔48h的心脏保护作用最强。2、异氟烷预处理可以激活ERK和p38MAPK、抑制JNK的活性。3、ERK、p38MAPK可能作为介导子参与异氟烷心肌延迟预处理信号转导抑制JNK激活可能也是异氟烷心肌延迟预处理的重要机制之一。4、c-fos、HSP27、c-jun可能是异氟烷心肌延迟预处理的末端效应子。5、异氟烷心肌延迟预处理可能通过激活ERK、p38MAPK及抑制JNK继而影响下游靶因子c-fos、HSP27、c-jun的转录，从而调控多种基因的表达和翻译，减轻心肌缺血再灌注损伤。