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克山病是一种病因尚不明确的地方性心肌病,因发现于黑龙江省克山县而得名。目前认为克山病病因主要由硒缺乏,单端胞霉烯类菌素以及心肌病毒三方面原因分别或共同作用造成,但这三种因素之间相互作用机制现在仍不清楚。T-2毒素是由镰刀菌,大部分是拟枝胞镰刀菌合成的一种代表性的A型单端胞霉烯类菌素。T-2毒素毒性较强,对人类和动物危害很大,在1973年的联合国粮农组织会议上将包括T-2毒素在内的这类毒素定为天然存在的最危险的食品污染源。已经有研究证明,T-2毒素能引起人类和动物的消化系统以及神经系统等损伤,并由于严重的内出血导致机体的快速死亡。硒是生物体内一种重要的微量元素,被认为是生物正常生长和代谢不可缺少的一种微量营养素,可以减轻氧化应激产生的细胞损伤。硒缺乏会引起机体代谢紊乱,某些代谢过程受阻,导致体内自由基大量积累而引发各种疾病。近年来研究发现,硒缺乏与心血管疾病间有着密切的关系。硒缺乏对T-2毒素的毒性作用的影响还未见报道,研究低硒对T-2毒素的影响有助于进一步了解克山病发病机制。本论文在建立了乳鼠原代心肌细胞无血清培养模型基础上,研究了硒缺乏条件下对T-2毒素损伤心肌细胞的毒性作用的影响,并对其影响机制做了进一步的探讨。具体研究内容如下:1.低硒加剧T-2毒素对心肌细胞的损伤作用。在含有2μM Se-Met的培养基中加入不同浓度的T-2毒素与细胞作用不同时间,用MTT法测定心肌细胞活性和用细胞上清液中LDH活力测定细胞损伤程度。结果显示,T-2毒素可以减弱心肌细胞活性,引起心肌细胞损伤,并随着T-2毒素浓度和作用时间的增加,毒性加大。在无血清培养的心肌细胞培养液中加入不同浓度的硒蛋氨酸(Se-Met)(0,0.5,1,2,4μM)预孵12h,然后向培养基中加入0.25μMT-2毒素继续培养24h。结果显示,当培养基中硒蛋氨酸浓度在2μM时,心肌细胞活性要明显强于其他组心肌细胞(P<0.05),细胞培养基上清中LDH释放量亦低于其他组心肌细胞培养基(P<0.05)。2.低硒加剧T-2毒素损伤心肌细胞的氧化应激机制。将不同浓度的T-2毒素加入心肌细胞培养基中作用24h,分别测定心肌细胞的SOD含量、GSH含量和MDA产生量。结果显示,SOD活性和GSH含量均随着T-2毒素浓度的增加而显著降低和减弱,MDA的产生量随着T-2毒素浓度的增加而增加。这说明T-2毒素可以引起心肌细胞的氧化应激损伤,并呈浓度依赖性,随着毒素浓度的增加,心肌细胞氧化应激反应也随之增加。用不同浓度Se-Met预孵12h,然后加入0.25μMT-2毒素培养24h,分别检测SOD活性、GSH含量和MDA产生量。结果显示,当Se-Met在细胞培养基中的浓度2μM时可以明显减缓T-2毒素引起的SOD活性和GSH含量降低以及MDA的产生(P<0.05)。由此我们可以得到结论,低硒加剧T-2毒素引起的心肌细胞氧化应激。3.低硒加剧T-2毒素引起体外心肌细胞损伤的的内质网应激机制。在培养的心肌细胞中加入0.25μMT-2毒素分别作用不同时间,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定CHOP和GRP78 mRNA表达量。结果显示,当T-2毒素作用心肌细胞3h时GRP78mRNA表达量明显升高(P<0.05),之后表达量逐渐下降;CHOPmRNA表达量随着T-2毒素作用时间的增加表达量增加,在T-2毒素作用6h时与对照组相比,CHOP mRNA表达量明显增加(P<0.05)。在心肌细胞培养基中加入不同浓度的T-2毒素(0.125,0.25,0.5μM)继续培养3h和12h,分别测定细胞GRP78mRNA和CHOP mRNA表达量。结果显示,0.25μM T-2毒素会引起心肌细胞GRP78 mRNA表达量上升(P<0.05),但是当T-2毒素浓度在0.5μM时,GRP78mRNA表达量反而下降;CHOPmRNA表达量随着T-2毒素浓度的增加而增加。在心肌细胞培养基中加入不同浓度的Se-Met预孵12h,然后加入0.25μM T-2毒素分别作用3h和12h,分别测定GRP78 mRNA和CHOP mRNA表达量。与对照组相比,T-2毒素在低硒环境下(0,μM)能使心肌细胞表达更多的GRP78和CHOP mRNA;但是当心肌细胞培养基中有充足的硒蛋氨酸时(2,4μM),能有效抑制T-2毒素引起的心肌细胞GRP78和CHOPmRNA表达上调。4.T-2毒素在缺硒环境下通过引起CHOP上调造成心肌细胞更加严重的损伤。用干扰RNAsiCHOP干扰心肌细胞CHOP的表达,然后用Se-Met和T-2毒素进行处理。结果显示,siCHOP可以抑制T-2毒素引起的CHOP mRNA表达(p<0.05);但是与单独加入siCHOP或Se-Met影响CHOP表达的作用相比,Se-Met和siCHOP同时作用于心肌细胞不能使CHOP mRNA表达量下降更多;siCHOP加入心肌细胞可以抑制T-2毒素引起的细胞活性下降和细胞损伤(P<0.05);同时与单独加入siCHOP或Se-Met影响CHOP表达的作用相比,Se-Met和siCHOP同时作用于心肌细胞亦不能使心肌细胞的活性得到更多的增加。本论文的研究结果显示,低硒加剧T-2毒素引起的鼠心肌细胞损伤,可以引起心肌细胞发生更加严重的氧化应激和内质网应激,当在培养基中加入生理浓度的硒时可以通过抑制CHOP的表达来减弱T-2毒素的毒性作用。这项研究有助于解释T-2毒素与硒之间的相互影响机制,为克山病病因提供了一种可能的解释,这对克山病病因研究具有重要的意义。