羔羊腹泻（lamb diarrhea）是世界范围内最常见的羊疫病之一,严重影响羔羊生长及发育,制约羊养殖业的健康发展。病原微生物感染是导致羔羊腹泻的主要原因,常见的引起羔羊腹泻的细菌性病原有大肠埃希氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等,对该病的主要病原菌进行快速检测,对羔羊腹泻的早诊断、早治疗具有积极意义。重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA）是一种新型等温核酸扩增技术,具有快速、灵敏、高效等特点,nfo RPA技术是进一步将侧流层析试纸条（Lateral flow strip detection,LFD）与RPA技术相结合,实现检测结果可视化,广泛应用于各个研究领域。本课题在生物信息学分析的基础上,结合PCR方法筛选羔羊腹泻主要致病菌的特异性标识基因;利用筛选出的特异性标识基因,建立大肠埃希氏菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌nfo RPA检测方法,为羔羊腹泻致病菌的临床检测提供新方法,并为羔羊腹泻的防控与治疗奠定基础。主要研究结果如下:1.查阅文献结合生物信息学分析,利用PCR方法,初步筛选到致病性大肠埃希氏菌特异性标识基因1个、沙门氏菌特异性标识基因3个和产气荚膜梭菌特异性标识基因3个及相应的特异性片段。确定以大肠埃希氏菌orf-3737基因、沙门氏菌hilA基因和产气荚膜梭菌colA基因作为后续建立nfo RPA快速检测方法的靶基因。2.基于orf-3737基因的特异性片段建立了大肠埃希氏菌nfo RPA检测方法。在39℃条件下,反应10 min即可通过LFD显示条带判定实验结果,与其他羔羊腹泻致病菌不发生交叉反应,最低检测量为4.3×102copies/μL,灵敏度是PCR方法的100倍,组间、组内重复性稳定。3.基于hilA基因的特异性片段建立了沙门氏菌nfo RPA检测方法。在39℃条件下,反应10 min即可通过LFD显示条带判定实验结果,与其他羔羊腹泻致病菌不发生交叉反应,最低检测量为4.7×102 copies/μL,灵敏度是PCR方法的100倍,组间、组内重复性稳定。4.基于colA基因的特异性片段建立了产气荚膜梭菌nfo RPA检测方法。在39℃条件下,反应10min,结合LFD即可观察判定结果,最低检测量可达5.0×102copies/μL,且不与其他致病菌发生交叉反应,组间、组内重复性稳定。5.采集宁夏地区腹泻羔羊临床样本47份,利用所建立的大肠埃希氏菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌nfo RPA方法进行检测,并将检测结果与PCR检测结果进行比较。结果显示,大肠埃希氏菌nfoRPA检测方法的阳性率为48.9%,PCR方法的阳性率为40.4%;沙门氏菌nfo RPA检测方法的阳性率为12.7%,PCR方法的阳性样本检测率为4.3%;产气荚膜梭菌nfo RPA检测方法的阳性率为44.6%,PCR方法的阳性率为38.2%。所建立的三种致病菌nfo RPA方法的阳性样本检出率均高于PCR方法检出率。综上所述,本研究建立的大肠埃希氏菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌nfo RPA检测方法具非设备依赖性,且耗时短、易于操作、特异性良好、灵敏度高、重复性好,适用于现场检测,可为羔羊腹泻的检测和防控提供技术支持。