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肺脏是人体的呼吸器官,由气管、支气管和肺泡构成。来源于肺的上皮性恶性肿瘤称为肺癌,是目前发病率和死亡率增长最快,对人类健康影响最大的恶性肿瘤之一。恶性肿瘤的生物学特性有增殖、浸润和转移,共同决定肿瘤的恶性程度,因此肺癌首要的治疗原则是抑制肺癌细胞的增殖。在中晚期肺癌的治疗中,顺铂是一线化疗药物,然而63%左右的肺癌患者在治疗中表现着对顺铂的耐药,这严重影响了肺癌患者的预后和中位生存期。因此阐明肿瘤增殖和顺铂耐药的机制并研发具有抑制作用的药物是肺癌研究的重点。研究表明,肿瘤细胞的增殖与细胞周期的紊乱密切相关,而细胞自噬和凋亡能够调节细胞周期过程并影响肿瘤细胞的增殖。另外化疗药物顺铂的作用机理是通过与细胞内的DNA结合形成化合物,抑制细胞的转录和复制过程,引起肿瘤细胞的凋亡而发挥作用。由此可知,DNA是顺铂的主要作用靶点,影响顺铂与DNA的结合或者后续的细胞凋亡过程都可以导致顺铂耐药的出现。研究表明,与此相关的分子通路包括氧化应激、细胞凋亡、自噬和铁死亡等。天然药物中能够分离出有明确的化学结构的单体,同时具有广泛的生物活性,如抗氧化、抗炎症和抗肿瘤等。与现代医学常规治疗手段相比,天然化合物治疗肿瘤的优势在于可通过多途径、多环节调控肿瘤的发生及进展。冬凌草甲素(Oridonin,Ori),是从冬凌草中提取的二萜化合物,有抗炎、抗氧化和抗肿瘤活性。因此,探究Ori对肺癌增殖的抑制作用、对铂类耐药的逆转作用及相关机制的研究是十分重要的。本论文将分为两大部分研究,第一部分选用A549细胞,首先探究Ori对A549细胞增殖的抑制作用及相关机制;然后讨论其对顺铂的增敏作用及相关机制。第二部分选用A549/DDP细胞,首先比较顺铂诱导A549和A549/DDP细胞相关蛋白表达的差异,讨论与顺铂耐药有关的机制;然后讨论Ori对顺铂耐药的逆转作用及相关机制的调节作用。在本实验中主要涉及CCK8法、克隆形成实验、免疫荧光、蛋白印迹以及AnnexinⅤ/PI双染法等技术。结果表明:在A549细胞中,Ori能够显著抑制细胞增殖,并且引起自噬小体的产生和自噬相关蛋白LC3B、P62和ATG3的激活;增强P-AMPK表达的同时抑制Akt/mTOR的磷酸化;引起促凋亡蛋白Bax和PARP、caspase3剪切体的激活以及抗凋亡蛋白Bcl2的抑制。进一步研究表明,加入AMPK抑制剂CC后,Ori对自噬和凋亡通路的诱导作用均被抑制;加入自噬抑制剂3-MA后,Ori对细胞凋亡的诱导作用被逆转。接下来的研究表明,Ori可以增强A549细胞对顺铂的敏感性,并且联用顺铂后增强Ori对AMPK/Akt/mTOR、自噬和凋亡通路的调节作用。这些结果表明,Ori的抗肿瘤和化疗致敏作用可能与AMPK/Akt/mTOR介导的自噬小体和凋亡通路的激活有关。在A549/DDP细胞中,顺铂可以抑制部分铁死亡相关蛋白(GPX4和FTH1)和自噬相关蛋白(P62和LC3B)的表达;降解Keap-1蛋白的同时能激活Nrf2的核转移和HO-1的蛋白表达;分别加入Ori、铁死亡诱导剂、自噬诱导剂和Nrf2抑制剂后,细胞生存率均明显下降。进一步研究表明,Ori能够引起亚铁离子和脂质过氧化的激活以及铁死亡相关蛋白(GPX4、xCT和FTH1)的抑制;引起LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化的同时抑制P62和P-mTOR的表达;抑制Nrf2/HO-1的同时激活Keap-1的表达。由此,我们推测Ori能够通过调节自噬、铁死亡和Keap-1/Nrf2逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药作用。综上所述,本研究证明了Ori对肺癌细胞增殖的抑制作用和对顺铂的增敏作用,首次阐明了Ori的抗肿瘤作用与自噬小体的关系,对顺铂的增敏作用与自噬、铁死亡、氧化应激和细胞凋亡的关系,为临床应用Ori协同顺铂治疗肺癌提供理论基础。