CFTR是ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters,ABC）中的一员,是一种Cl-离子转运通道,它提供了一种Cl-穿过细胞膜转运的路径,在此基础上调节Cl-跨膜转运的速率,除了作为液体流动及离子浓缩的中心外,CFTR还能决定盐分的跨上皮膜运输,因此,CFTR在腹泻的发生中起着至关重要的调控作用。本课题首先构建小鼠的渗透性腹泻模型,选取腹泻小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠组织为研究对象,对小鼠肠道组织中的CFTR进行表达分析、分布及定位检测,通过构建CFTR表达载体的体外细胞培养试验,研究CFTR重组蛋白对与腹泻相关离子的转运作用,阐明CFTR蛋白与腹泻之间的关系。首先,采用甘露醇灌胃的方法构建小鼠腹泻模型,灌胃40min左右小鼠开始出现腹泻症状,精神萎靡,行动迟缓,粪便呈现稀软状态;小鼠的腹泻症状随着时间的延长呈现加重趋势,粪便呈现水样。将腹泻3h、9h的小鼠断颈处死,取其十二指肠、空肠、回肠及结肠组织。对CFTR基因的NBD1、NBD2结构域及NKCC1基因进行克隆,PCR及免疫组化结果均显示上述三种基因在正常组、腹泻3h组、腹泻9h组的十二指肠、空肠、回肠及结肠组织均有表达。荧光定量结果显示三种基因在不同肠组织中的表达量存在差异,这可能是由于高渗环境的存在使得该三种基因的表达发生变化。其次以小鼠基因组DNA为模板合成CFTR-NBD1、CFTR-NBD2基因的简并引物,进行小鼠CFTR蛋白核苷酸结构域的扩增、克隆、测序,分别得到690bp、666bp的基因片段,翻译成氨基酸序列,大小分别为230aa、222aa,经氨基酸序列比对发现所获得的CFTR-NBD1和CFTR-NBD2氨基酸序列都存在ABC蛋白家族特征性序列,初步确定本次PCR所扩增出的核苷酸产物是小鼠ABC蛋白的一段ATP结合区序列。分别将CFTR-NBD1、CFTR-NBD2基因的重组克隆质粒与真核表达质粒pEGFP-N1均用限制性内切酶进行双酶,切酶切产物用T4连接酶进行连接,构建重组真核表达质粒pEGFP-N1-CFTR-NBD1、pEGFP-N1-CFTR-NBD2,通过PCR扩增、双酶切和测序鉴定,结果表明成功构建了小鼠CFTR-NBD1、CFTR-NBD2的真核表达载体。最后,采用脂质体转染法将重组真核表达质粒pEGFP-N1-CFTR-NBD1、pEGFP-N1-CFTR-NBD2导入小鼠IEC细胞内,空白组的IEC细胞未做任何处理,对照组用空质粒pEGFP-N1转染小鼠IEC细胞,结果在荧光显微镜下观察到转染组和对照组有荧光出现,空白组未见荧光,表明目的基因CFTR-NBD在IEC细胞中成功表达。收集细胞培养液作为细胞外液,收集细胞并用细胞破碎仪制成细胞悬液作为细胞内液,分别检测细胞内外液中Na⁺、K⁺、Cl^-3种离子浓度,并进行显著性分析,结果表明在CFTR-NBD蛋白的作用下,这3种离子被从细胞内转运到细胞外。因此,确定此次获得的CFTR-NBD是小鼠CFTR蛋白的核苷酸结合区基因,且CFTR-NBD蛋白有离子转运功能。综上所述,本课题首次在渗透性腹泻小鼠模型中探讨CFTR-NBD、NKCC1基因的表达,构建真核表达载体pEGFP-N1-CFTR-NBD,对小鼠IEC进行培养并将CFTR-NBD基因导入小鼠IEC中,使其成功表达,通过检测3种离子浓度,发现CFTR-NBD蛋白有转运这3种离子的功能。小鼠CFTR-NBD基因的成功克隆和表达有望通过揭示小鼠CFTR转运蛋白的功能及转运机制以便找到治疗腹泻的药物分子的靶位,最终达到用药物预防和治疗畜禽腹泻的目的。