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目的:砷是一种广泛存在于水、土壤和空气中的类金属元素,是国际癌症机构确认的人类I类致癌物。砷与膀胱癌的发生有关,饮水砷暴露可增加膀胱癌的发病率和死亡率,但其分子机制仍不明确。无机砷是少数几种不会轻易在实验动物中诱发肿瘤的人类致癌物之一,因此,无机砷诱发的体外细胞癌变模型对于更好地了解潜在的致癌过程至关重要。二甲基砷（DMA）是人类和动物尿液中最丰富的砷物质,是大鼠特有的膀胱致癌物。砷是通过扰乱特殊位点的外遗传控制,导致基因异常表达而致癌。谷氨酰胺（Gln）是血浆中含量最丰富的氨基酸,在癌细胞的许多过程中发挥着关键作用。丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白2（SLC1A5）介导包括Gln在内的氨基酸的交换,对于迅速生长的肿瘤细胞摄取Gln至关重要。SLC1A5在多种癌细胞中表达上调,抑制SLC1A5阻止Gln摄取可以有效抑制癌细胞增殖。Gln通过SLC1A5转运进入细胞后代谢生成α-酮戊二酸（α-KG）,这一过程可以激活mTORC1。mTORC1被激活后,通过磷酸化其底物p70S6K和4EBP1来调节翻译和细胞增殖。摄取Gln是合成还原型谷胱甘肽（GSH）的限速步骤,GSH是细胞内最重要的抗氧化剂,在抵抗癌细胞快速代谢产生的氧化应激中发挥着重要作用,细胞内活性氧（ROS）水平的稳定有助于β-catenin表达维持在高水平。癌细胞内β-catenin高水平表达在促进细胞增殖、药物抵抗以及肿瘤干细胞（CSCs）干性维持方面起到关键作用。CSCs是肿瘤中保留了胚胎特性的一类亚群细胞。CSCs具有自我更新的特性,在促进肿瘤生长、转移及药物抵抗等方面发挥重要作用。本研究通过建立亚慢性亚砷酸钠（Na As O2）和DMAV暴露的大鼠动物模型,探讨亚慢性砷暴露对大鼠膀胱上皮细胞增殖以及SLC1A5、mTORC1、β-catenin的影响;通过建立长期和短期Na As O2处理人正常膀胱上皮细胞（SV-HUC-1）模型,探讨SLC1A5在调控无机砷处理SV-HUC-1细胞增殖和自我更新中的作用及机制,为砷致膀胱癌的机制研究提供依据。研究方法:1、将30只初断乳雌性F344大鼠随机分为3组,对照组:饮用蒸馏水,无机砷染毒组:饮用水中含有87 mg/L Na As O2(50 mg/L As3+),有机砷染毒组:饮用水中含有200 mg/L DMAV,连续染毒12周;采用HE染色法检测大鼠膀胱上皮细胞增殖情况;采用免疫组织化学方法检测大鼠膀胱上皮细胞Ki67和SLC1A5表达水平;采用免疫荧光方法检测大鼠膀胱上皮细胞SLC1A5、p70S6K、p-p70S6K、4EBP1、p-4EBP1以及β-catenin表达水平。2、用0或0.5μM Na As O2处理SV-HUC-1细胞10、20、30、40周,构建长期无机砷处理细胞模型;用0、0.5、1、2、4、8μM Na As O2处理SV-HUC-1细胞24小时,构建短期无机砷处理细胞模型;应用CCK-8法检测细胞活力;平板克隆实验检测细胞克隆形成能力;细胞球形成实验检测细胞自我更新能力;应用Western blot法检测全细胞中SLC1A5、PCNA、Cyclin D1、CD44、SOX2、OCT4、β-catenin的蛋白表达水平和p70S6K、4EBP1蛋白磷酸化水平以及细胞质和细胞核中β-catenin表达水平;应用q RT-PCR法检测细胞中SLC1A5、Cyclin D1、CD44、SOX2、OCT4的m RNA表达水平;免疫荧光方法检测细胞中β-catenin表达;试剂盒检测细胞内GSH含量;应用ROS荧光探针检测细胞中ROS水平;对细胞进行Gln饥饿处理后检测以上相关指标;分别应用SLC1A5抑制剂、si-SLC1A5以及慢病毒转染过表达SLC1A5后检测以上相关指标;应用SLC1A5抑制剂和m TOR激动剂联合处理细胞后,检测以上相关指标;用si-β-catenin处理细胞后,检测以上相关指标;分别用SLC1A5抑制或si-SLC1A5与β-catenin激动剂联合处理细胞后,检测以上相关指标;SLC1A5过表达细胞转染si-β-catenin,检测以上相关指标;分别用SLC1A5抑制剂或si-SLC1A5与ROS清除剂联合处理细胞后,检测以上相关指标。结果:1、与对照组大鼠相比,Na As O2和DMAV组大鼠膀胱上皮细胞层数明显增加,Ki67阳性细胞率显著升高（P＜0.01）;与对照组大鼠相比,Na As O2和DMAV暴露组大鼠膀胱上皮细胞中SLC1A5、p70S6K、p-p70S6K、4EBP1、p-4EBP1及β-catenin表达水平显著升高（P＜0.05）。2、0.5μM Na As O2处理10周后,SV-HUC-1细胞Gln摄取显著增加（P＜0.01）,且其水平随砷处理时间延长而升高;Gln饥饿可以减弱长期无机砷处理SV-HUC-1细胞增殖及自我更新（P＜0.05）。3、4μM Na As O2处理24小时后,SV-HUC-1细胞中SCL1A5的m RNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）;0.5μM Na As O2处理40周显著升高SV-HUC-1细胞中SCL1A5的m RNA和蛋白表达水平（P＜0.05）;SLC1A5抑制剂和si-SLC1A5均显著抑制长期无机砷处理SV-HUC-1细胞增殖和自我更新（P＜0.05）;过表达SLC1A5显著增强长期无机砷处理SV-HUC-1细胞增殖和自我更新（P＜0.01）。4、4μM Na As O2处理24小时后,SV-HUC-1细胞中p70S6K和4EBP1蛋白磷酸化水平升高（P＜0.01）;0.5μM Na As O2处理40周显著升高p70S6K和4EBP1蛋白磷酸化水平（P＜0.05）;SLC1A5抑制剂和si-SLC1A5处理均降低p70S6K和4EBP1蛋白磷酸化水平（P＜0.05）,过表达SLC1A5升高p70S6K和4EBP1蛋白磷酸化水平（P＜0.01）;dm-αKG升高p70S6K和4EBP1蛋白磷酸化水平（P＜0.05）,并逆转了SLC1A5抑制剂和si-SLC1A5对p70S6K和4EBP1蛋白磷酸化水平的抑制作用（P＜0.05）;m TOR激动剂能够恢复SLC1A5抑制剂对mTORC1活化的抑制作用（P＜0.05）,并恢复细胞活力（P＜0.05）,克隆形成能力（P＜0.01）以及Cyclin D1和PCNA蛋白表达水平（P＜0.05）。5、0.5μM Na As O2处理40周后,SV-HUC-1细胞的全细胞、细胞质及细胞核中的β-catenin表达水平显著升高（P＜0.05）;SLC1A5抑制剂降低全细胞、细胞质及细胞核中的β-catenin表达水平（P＜0.05）;过表达SLC1A5使长期无机砷处理SV-HUC-1细胞的全细胞、细胞质及细胞核中的β-catenin表达水平进一步升高（P＜0.01）;转染si-β-catenin后,长期无机砷处理细胞的细胞活力和克隆形成能力降低（P＜0.01）,CD44、OCT4、SOX2以及Cyclin D1的m RNA和蛋白表达水平降低（P＜0.05）。6、β-catenin激动剂能够逆转SLC1A5抑制剂和si-RNA对β-catenin表达的抑制作用（P＜0.05）,并恢复细胞增殖和自我更新能力（P＜0.05）;si-β-catenin能够降低SLC1A5过表达细胞的增殖和自我更新能力（P＜0.01）。7、SLC1A5抑制剂和si-SLC1A5均导致长期无机砷处理SV-HUC-1细胞内GSH水平显著降低（P＜0.01）,ROS水平显著升高（P＜0.01）;ROS清除剂NAC有效降低SLC1A5抑制剂和si-SLC1A5所致的细胞内ROS水平升高（P＜0.01）,恢复全细胞、细胞质及细胞核中β-catenin蛋白表达水平（P＜0.05）,并恢复细胞增殖和自我更新（P＜0.05）。结论:1、亚慢性砷暴露诱导大鼠膀胱上皮细胞过度增殖,上调SLC1A5和β-catenin表达水平,并促进mTORC1活化。2、长期无机砷处理增加SV-HUC-1细胞Gln摄取,Gln饥饿抑制细胞增殖及自我更新。短期和长期无机砷处理均可诱导SV-HUC-1细胞SLC1A5表达上调;SLC1A5通过α-KG调控mTORC1活化介导细胞增殖;SLC1A5通过GSH-ROS调控β-catenin表达介导细胞增殖和自我更新。