论文部分内容阅读
结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）感染导致的呼吸道传播性疾病,每年致死人数超过200万。在2015年全球结核病致死人数已经超过艾滋病,使得结核病成为十大致死病因之一。我国是全球结核疫情及经济负担最重的五个国家之一。2012年我国仅在结核病患住院诊疗上的支出逾17亿元人民币。因此,迫切需要深入研究MTB的致病机理,开发出有效的新型结核病诊疗手段。巨噬细胞是机体天然免疫系统抗MTB感染的第一道防线,也是适应性免疫系统清除MTB重要的效应细胞。巨噬细胞活化后,通过增强吞噬力,启动呼吸爆发,释放促炎因子,酸化吞噬溶酶体,强化抗原加工和递呈功能等方式清除胞内感染的MTB。而MTB感染致病的关键是逃逸巨噬细胞的免疫杀伤。早期分泌抗原ESAT6（Early secreted antigenic target 6-kDa）是MTB重要的毒力因子,由ESX-1分泌系统分泌,参与MTB对巨噬细胞的天然免疫功能的调控,但其具体机制仍不明确。研究提示,吞噬体内ESAT6的分泌帮助MTB从吞噬溶酶体中转位到胞浆,进而逃逸吞噬溶酶体的杀伤,这可能是结核感染扩散的关键环节。而胞外ESAT6刺激能够促进巨噬细胞分泌IL6,TNF等促炎性因子;并活化Caspase酶导致巨噬细胞凋亡,反而利于巨噬细胞限制MTB。那么,ESAT6在吞噬体内刺激对巨噬细胞的生存活化产生怎样的影响?与胞外ESAT6刺激有何不同?在本课题中,我们通过构建ESAT6纳米胶囊把ESAT6输送到THP-1巨噬细胞的吞噬体中;发现ESAT6从吞噬体中刺激对THP-1巨噬细胞生存、促炎性活化、糖代谢的作用与胞外ESAT6刺激有明显不同。为什么胞外刺激与吞噬体内刺激会有如此不同的效应?我们采用高通量RNA测序技术,系统研究并比较了上述两种刺激方式后,发现两种刺激方式下THP-1巨噬细胞在促炎性活化方面作用相异;提出了在ESAT6调控THP-1巨噬细胞炎性活化的可能机制。最后,我们观察了多种炎性细胞因子通路分子在鉴别不同结核感染状态人群中的价值。研究目的1、建立吞噬体内ESAT6刺激巨噬细胞的处理模型,并观察吞噬体内和胞外ESAT6刺激对巨噬细胞作用效应的区别。2、明确巨噬细胞分别应对胞外和吞噬体内ESAT6刺激时,转录水平总体反应特征。3、分析胞外和吞噬体内ESAT6两种刺激方式下,巨噬细胞转录水平总体反应异同。4、探索ESAT6调控THP-1巨噬细胞促炎性活化的可能机制。5、观察CMPK2,MALAT1和炎性细胞因子通路分子在鉴别不同结核感染状态人群中的价值。研究方法1、吞噬体内ESAT6刺激巨噬细胞处理模型的建立,以及吞噬体内和胞外ESAT6刺激对巨噬细胞作用效应的观察首先我们采用酸性环境可降解的有机分子构建了ESAT6纳米胶囊,通过扫描电子显微镜和原子力显微镜技术表征ESAT6纳米胶囊的大小形态。通过激光共聚焦显微镜,观察ESAT6纳米胶囊被巨噬细胞吞噬后的亚细胞定位情况,确定ESAT6纳米胶囊是否成功定位于吞噬体内。随后,我们观察细胞外和吞噬体内两种刺激方式下,相同浓度的ESAT6对THP-1巨噬细胞生存（凋亡、死亡）、促炎性活化（IL1,6,8,10,TNFα等炎性因子分泌水平）及巨噬细胞极化状态下糖代谢（葡萄糖消耗量、乳酸产生量）的影响。2、研究巨噬细胞分别应对胞外和吞噬体内ESAT6刺激时,转录水平总体反应特征我们采用高通量RNA测序技术,通过GO分析和IPA通路及分子网络分析,研究了在细胞外和吞噬体内两种刺激方式下,ESAT6对THP-1巨噬细胞转录水平的影响。3、分析胞外和吞噬体内ESAT6两种刺激方式下,巨噬细胞转录水平反应异同针对胞外和吞噬体内ESAT6两种刺激方式下,巨噬细胞同向或异向表达的差异基因,采用GO分析获取这些基因的功能特征,以反映两种刺激方式下巨噬细胞转录组水平改变的差异性。4、探索ESAT6调控THP-1促炎性活化的可能机制根据测序数据分析结果,我们采用siRNA技术初步探索差异表达基因CMPK2和MALAT1在ESAT6导致的巨噬细胞促炎性活化反应中的作用机制。5、观察CMPK2,MALAT1和炎性细胞因子通路分子在鉴别不同结核感染状态人群中的价值收集临床上不同结核感染状态病人的外周血标本。观察不同结核感染状态下,患者PBMC中CMPK2,MALAT1和炎性信号分子的表达差异,研究其对结核感染状态的鉴别价值。研究结果1、成功建立吞噬体内ESAT6刺激巨噬细胞的处理模型首先,我们成功合成了ESAT6纳米胶囊,经原子力显微镜和扫描电子显微镜表征,纳米胶囊的直径在200-500 nm范围。经激光共聚焦显微镜观察,确认纳米胶囊被巨噬细胞吞噬后与溶酶体共定位。证明通过纳米胶囊方式可以实现向巨噬细胞的吞噬体内输送ESAT6抗原的目的。其次,我们观察到在细胞外和吞噬体内两种刺激方式下,ESAT6对THP-1巨噬细胞生存、促炎性活化、糖代谢的作用有明显不同。两种方式都能导致THP-1巨噬细胞凋亡,但胞外方式倾向于快速促进THP-1细胞发生晚期凋亡和死亡;而在吞噬体内刺激下,THP-1巨噬细胞晚期阶段（24 h）凋亡明显,细胞坏死水平升高不太明显。在ESAT6刺激早期（4h）,细胞外ESAT6刺激促进巨噬细胞促炎性因子的分泌;而吞噬体内刺激则倾向于抑制巨噬细胞的促炎效应。在糖代谢方面,ESAT6从胞外刺激导致巨噬细胞糖摄取量和乳酸产生量都明显增加;而吞噬体内刺激组,巨噬细胞糖摄取量和乳酸产生量都明显降低。2、巨噬细胞分别应对胞外和吞噬体内ESAT6刺激时,转录水平总体反应特征RNA测序数据分析得出大量在结核感染研究中尚未涉及的分子及信号通路。在ESAT6胞外处理4h“Acute Phase Response Signaling”显著富集,以及“cAMP Signaling”在24h处理组显著富集,提示胞外ESAT6的促炎性反应效应。吞噬体内ESAT6刺激THP-1巨噬细胞4h、24 h后,共同最显著富集的5个上游调节分子都与炎症反应密切相关,其下游信号分子在测序数据中均呈下调表现,提示吞噬体内ESAT6刺激抑制THP-1巨噬细胞的炎性信号。3、胞外和吞噬体内ESAT6两种刺激方式下,巨噬细胞在促炎活化方面反应相异我们重点关注了在4h胞外刺激表达上调,同时吞噬体内刺激表达下调的数据集（ESAT64hup+nESAT64hdown）。GO分析得出该数据集最显著富集的5个生物学过程注释“cellular response to interleukin-1”,“cellular response to tumor necrosis factor”,“monocyte chemotaxis”,“cellular response to interferon-gamma”和“chemokine-mediated signaling pathway”都与巨噬细胞炎性反应和巨噬细胞活化密切相关。进一步提示在ESAT6刺激早期（4h）,细胞外ESAT6刺激导致巨噬细胞促炎性反应;而吞噬体内ESAT6刺激则倾向于抑制巨噬细胞的促炎反应。4、ESAT6调控THP-1巨噬细胞促炎性活化的可能机制首先,胞外ESAT6处理THP-1巨噬细胞后,RNA测序和qPCR数据都显示,CMPK2水平显著升高。siRNA干扰CMPK2后,THP-1巨噬细胞IL1β分泌水平不受影响,但巨噬细胞葡萄糖消耗量降低,吞噬功能降低。胞外ESAT6处理THP-1巨噬细胞后,细胞内HIF1α蛋白水平升高。siRNA干扰HIF1α后,THP-1巨噬细胞乳酸产生水平、ROS产生水平和吞噬能力均显著降低。生物信息学预测HIF1α能结合到CMPK2启动子区域,并且激活CMPK2的表达。提示ESAT6可能通过HIF1α转录激活CMPK2表达进而促进THP-1的促炎性活化效应。其次,RNA测序和qPCR数据也都显示ESAT6胞外刺激后,MALAT1表达水平在THP-1巨噬细胞内显著下调。在ESAT6作用的基础上,siRNA干扰MALAT1后,更加显著的提高THP-1巨噬细胞中IL1β,IL8和TNFα等促炎性因子的分泌水平。初步提示ESAT6抑制MALAT1的抑炎性效应,而促进THP-1的促炎性功能。5、CMPK2,MALAT1和炎性细胞因子通路分子对鉴别不同结核感染状态的价值我们观察了CMPK2,MALAT1和多个细胞因子及细胞因子受体在活动性结核感染、潜伏性结核感染以及非结核其他肺部感染患者中的表达水平。发现MALAT1水平可用于鉴别活动性结核感染和非结核其他呼吸道感染性疾病。同时,IL10+IL12组合最能显著鉴别活动性结核感染、潜伏性结核感染。主要结论纳米胶囊手段能用来研究吞噬体内抗原的刺激效应。细胞外ESAT6刺激促进巨噬细胞的促炎性效应,而吞噬体内ESAT6刺激则抑制巨噬细胞的促炎性反应。ESAT6可能通过上调CMPK2分子表达,下调MALAT1表达来促进巨噬细胞炎性活化。MALAT1和炎性信号分子水平能用来鉴别不同结核感染状态。研究意义本研究提供了一种研究吞噬体内胞内感染菌的毒力因子对宿主巨噬细胞刺激作用的手段。并且提示了结核抗原ESAT6在吞噬体内对巨噬细胞的刺激作用是抑制炎性反应,与胞外ESAT6刺激的促炎性效应相反。这为我们深入了解结核抗原ESAT6在结核感染致病中的作用,以及根据ESAT6的不同效应开发新型的结核感染控制措施提供了新的思路。