研究背景与研究目的:心力衰竭（HF）是各种心血管疾病发展的终末阶段,给世界带来巨大的临床和经济负担。虽然目前HF有肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂、交感神经系统抑制剂以及血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂等多种治疗药物,但HF的发病率和死亡率依然很高。因此探索新的HF治疗策略已成为当务之急。运动是众所周知的能够改善心血管健康的非药物干预手段,且运动训练已被推荐为HF患者治疗的重要组成部分。但是并非所有HF患者都适合运动疗法治疗。因此阐明运动有益的潜在分子机制,为HF提供新的治疗靶标具有重要意义。病理性心肌肥厚是心衰进展的主要独立危险因素之一,而运动引起的生理性心肌肥厚却对机体有益。据报道前运动员的收缩压明显低于与其年龄匹配的对照人群,同时有文献发现前精英运动员的寿命比对照组长5-6年,这意味着年轻时期的一段精英运动员生涯在运动引起的生理性心肌肥厚消退后也能起到保护作用。我们以前曾报道过一种称为心肌肥厚预适应的现象,即心脏经历短期病理性肥厚性刺激对随后的长期病理性肥厚刺激具有保护作用,并延缓HF的进展。但是,在生理性心肌肥厚消退后（例如体育锻炼引起的心肌肥厚）,其对随后的病理性肥厚性刺激的抵抗作用几乎没有被研究过。因此,我们假设运动引起的生理性心肌肥厚消退后,运动诱导的抗肥厚记忆仍然存在。在这项研究中,我们使用了游泳运动小鼠来验证这一假设,并确认在心脏富集的长链非编码（LNC）RNA肌球蛋白重链相关的RNA转录物（Mhrt）在运动肥厚预适应的调节机制。研究方法:1.小鼠游泳运动方案南方医科大学动物中心提供的C57BL/6雄性小鼠（8-10周龄,体重22-25 g）。运动肥厚预适应组小鼠游泳运动首先开始15分钟的两次训练,每两天增加15分钟,直到达到两次90分钟的训练（每星期运动5天,每周休息2天）。接下来的7天每天继续游泳两次90分钟。该方案总共21天。两次游泳至少间隔6个小时。游泳运动期间始终密切观察小鼠以避免呛水或缺氧。久坐组的小鼠可以在笼子中自由活动。运动训练结束后1周,所有小鼠均进行经主动脉缩窄（TAC）或假手术。2.左室压力负荷模型制备用氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）的混合物腹腔注射麻醉小鼠。小鼠经呼吸机通气后打开胸腔以暴露主动脉弓。在无名动脉和左颈动脉之间放置7-0丝线。将26号针头放置在丝线周围,并将丝线打结;然后拔出针头,造成主动脉弓狭窄。关闭胸腔后将小鼠放入笼中待其自然苏醒。对假手术的小鼠进行相同的操作,但不将丝线打结。手术后4周,对小鼠进行超声心动图和血流动力学检测。3.超声心动图及有创的血流动力学分析用Vevo 2100系统进行小鼠心脏超声检测。调整异氟醚的吸入流量来麻醉小鼠,并维持小鼠心率在450-550次/分钟。在左室（LV）短轴乳头肌水平记录M型图像,并测量左室舒张末期和收缩末期内径（LVEDd,LVESd）,左室舒张期和收缩期后壁厚度（LVPWd,LVPWs）;计算左室射血分数和缩短分数（LVEF,LVFS）。在处死动物之前评估LV血液动力学。如上所述,小鼠经麻醉,插管后,将1.0 F的导管插入右颈动脉并推送至LV。记录有关LV收缩压和舒张末期压的数据（LVSP,LVEDP）以及LV压的最大和最小变化率（dp/dtmax和dp/dtmin）。使用Power Lab软件计算左室收缩力和左室舒张指数时间常数（τ）。4.腺相关病毒（AAV）的转染使用带有30号针头的注射器在8周龄的小鼠左室游离壁、心尖部和后侧壁（3 个部位,10μl/部位）直接注射 pAAV9-CMV-ZsGreen-Mhrt779（AAV-Mhrt779）或pAAV9-CMV-ZsGreen-shMhrt779（AAV-shMhrt779）或对照（Scramble）病毒颗粒（1×1011病毒颗粒/ml）。AAV注射4周后,对小鼠进行耐力运动训练,然后行TAC或假手术。5.组织学检测TAC4周后对小鼠称重后予安乐死,采集心脏、肺脏和胫骨等相关数据。心脏经固定、脱水、石蜡包埋以及切片后,分别行苏木素伊红染色（HE）、麦胚凝集素染色（WGA）和马松三色染色（masson）进行心肌肥厚和心肌纤维化分析。6.质谱全面鉴定RNA结合蛋白（ChIRP-MS）心脏经甲醛进行可逆交联,随后用生物素标记的RNA anti-sense进行杂交。通过强变性条件洗去非特异结合蛋白后,得到的RNA结合蛋白（RBP）经LC-MS/MS鉴定和定量分析,与目标RNA特异性相互作用的蛋白在两组间具有显著差异。7.心肌细胞的分离培养和腺病毒转染将新生大鼠或小鼠的原代心肌细胞和成纤维细胞进行分离和培养。培养48小时后,将心肌细胞与重组 ad-Mhrt779（Ad-hU6-MCS-CMV-EGFP-Mhrt779）或 ad-shMhrt779（Ad-hU6-MCS-CMV-EGFP-shRNA-Mhrt779）共培养 24 小时。然后将培养基替换为无血清DMEMF12,再用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）（1μM）刺激。在Ang Ⅱ刺激24小时后,收集培养的心肌细胞用于分析细胞表面积,蛋白质免疫印迹实验和PCR,以检测敲低（Ad-shMhrt）或过表达（Ad-Mhrt）Mhrt779对心肌细胞肥大的影响。8.统计分析计量数据以均数±标准误（mean 士 SE）表示,统计显著性差异分析采用t检验或one-way或two-way ANOVA,多重比较采用Bonferroni’S矫正。本研究所有统计学分析中,P<0.05代表具有统计学意义。结果:1.运动肥厚预适应减轻病理性心肌肥厚游泳运动21天后,运动组心重/体重（HW/BW）和HW/胫骨长度（HW/TL）较静息（Sed）组增加约10%。心脏超声结果表明运动组LV室壁厚度明显增加。组织学染色结果显示运动组小鼠心肌细胞横截面积增加但心肌纤维化未见明显变化。qPCR显示两组心肌肥厚的标志物Nppa和Myh7基因的表达无差异。在停止运动7天后,运动组的HW/BW和HW/TL恢复至基线水平。以上数据表明运动可以引起生理性心肌肥厚,停止运动后生理性心肌肥厚消退（这一过程称为运动肥厚预适应,EHP）。TAC 7天后,EHP小鼠LV后壁的厚度（LVPWd和LVPWs）比Sed组小。与Sed组相比,EHP显著降低了 TAC引起的小鼠的HW/BW和HW/TL比值、心肌细胞横截面积、心肌纤维化以及胚胎基因Nppa和Myh7的表达。2.EHP延缓心衰进展我们将TAC术后的观察期延长至4周,以观察EHP对HF的影响。TAC 4周后,心脏超声结果显示EHP+TAC组的LVPWd、LVPWs、LVEDd和LVESd明显小于Sed+TAC组,而其LVEF和LVFS比Sed+TAC组更高。血流动力学检测发现:相比于Sed+TAC组,EHP+TAC组的LVEDP和τ更低,而dp/dt max、dp/dt min和左室收缩指数更高。TAC 4周后,EHP可明显减轻心肌肥厚程度的指标（HW/BW和HW/TL）和TAC诱导的充血性心力衰竭的指标（LW/BW和LW/TL）。马松染色证实与Sed+TAC组相比,EHP+TAC组心肌纤维化更轻。以上结果表明EHP可抑制病理性心肌肥厚,延缓心衰进展。3.EHP上调心肌内lncRNAMhrt779的表达我们通过qPCR筛选发现富含于心肌细胞核内的lncRNA mhrt779（Mhrt779）在EHP小鼠的心肌细胞中被显著上调。在压力负荷后,EHP+TAC组中的Mhrt779在TAC1周及TAC4周都显著高于Sed+TAC组。4.过表达或敲低Mhrt779可分别增强或削弱运动肥厚预适应的抗肥厚作用心肌内注射AAV-Mhrt779或AAV-shMhrt779 4周后可分别增加或降低心肌内Mhrt779的表达水平。AAV注射4周后,所有小鼠均接受EHP,随后进行TAC或假手术。超声心动图显示Mhrt779的过表达显着降低了 TAC 4周引起的LVPWd和LVPWs的增加。与Scramble+TAC组相比,Mhrt779+TAC组的HW/BW、HW/TL、心肌细胞横截面积以及心肌的纤维化均明显下降。而心肌内敲低Mhrt779时,与Scramble+TAC 组相比,Sh-Mhrt779+TAC 组的 LVPWd、LVPWs、HW/BW、HW/TL、心肌细胞横截面积以及心肌的纤维化都显著增加。5.Mhrt779与Brg1/Hdac2的复合物结合,抑制Hdac2/Akt/GSK3β信号通路我们通过CHIRP-MS证实Brg1是mhrt779的特异性结合蛋白,并用免疫共沉淀在TAC 4周小鼠的心脏中证实Brg1与Hdac2互相结合形成复合物。蛋白免疫印迹实验结果证实:过表达Mhrt779可抑制压力负荷下Hdac2/Akt/GSK3β信号通路的活化,而敲低Mhrt779则增强压力负荷下Hdac2/Akt/GSK3β信号通路的活化。6.Mhrt779减轻AngⅡ诱导的心肌细胞肥厚我们发现Mhrt779过表达显着抑制了 NRCM中Ang Ⅱ引起的心肌细胞肥厚和肥厚标志物（Nappa,Myh7）。Western blot结果表明,AngⅡ激活的Hdac2/Akt/GSK3β通路被Mhrt779过表达所阻断。然而,在Ang Ⅱ刺激的NMCM中,用Ad-shMhrt779处理后可明显促进心肌肥厚、上调Nappa和Myh7的基因表达,并增加Hdac2,p-Akt和p-GSK3β的蛋白质表达。结论:1.运动可以引起生理性心肌肥厚,心肌肥厚消退后仍具有抗病理性心肌肥厚的能力,从而延缓心力衰竭的进展,即存在“运动肥厚预适应”现象。2.lncRNA mhrt779在运动肥厚预适应的心肌细胞中显著上调,并具有抗病理性心肌肥厚的效应。3.lncRNAmhrt779通过与Brg1结合,抑制病理性刺激引起的Hdac2/Akt/GSK3β信号通路的活化。