隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种世界范围内常见的能够引起水源性及食源性腹泻疾病爆发的寄生性原虫。全球肠道中心研究确定隐孢子虫病是导致2岁以下儿童中重度腹泻的首要原因之一,仅次于轮状病毒,能够引起免疫功能低下、营养不良的儿童持续性的腹泻,并导致生长缓慢、认知障碍,甚至死亡。目前可以有效治疗隐孢子虫病的药物和疫苗尚未研制出来,因此研究隐孢子虫的致病机制具有重要的公共卫生学意义。基于此,建立人和动物隐孢子虫病的早期诊断方法至关重要。关于直接检测隐孢子虫卵囊和间接检测虫体的ELISA检测方法已经有很多种,但是用隐孢子虫卵囊壁蛋白作为免疫原的ELISA检测方法尚未被研究,由于体外检测技术无法检测到子孢子抗原,因此使用卵囊壁上某一特定蛋白作为免疫原可能会使检测方法更具敏感性、高效性。本研究采用C.parvum和C.andersoni卵囊,进行体外脱囊收集纯化其卵囊壁,运用Label-free全蛋白定性组学分析卵囊壁蛋白组成,通过蛋白组学数据和隐孢子虫卵囊壁分子组成特性预测出可能定位于卵囊壁表面蛋白进行重组表达,以期筛选出微小隐孢子虫卵囊壁表面和安氏隐孢子虫卵囊壁表面可以用来作为检测的潜在靶标蛋白,进而实现隐孢子虫的体外快速检测。1.微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁的分离纯化本研究利用实验室保存的微小隐孢子虫和收集的安氏隐孢子虫卵囊,采用胆酸盐、脱囊液和37℃水浴加热的方式刺激隐孢子虫脱囊,脱囊完成后,显微镜下观察到两种隐孢子虫脱囊率均达80%以上,活性良好,随后采用梯度Percoll细胞分离液对隐孢子虫卵囊壁进行分离纯化,纯化后的隐孢子虫卵囊壁视野干净,无杂质,有个别完整卵囊掺杂其中,符合后续蛋白组学试验要求。本研究通过对隐孢子虫卵囊壁分离方法的改进,可以快速获得大量高纯度的隐孢子虫卵囊壁,为进一步研究隐孢子虫卵囊壁的结构及其分子组成奠定基础。2.微小隐孢子虫卵囊壁和安氏隐孢子虫卵囊壁定性蛋白组学鉴定本研究使用非标定性,高效液相色谱分级分离和基于质谱的定性蛋白质组学技术,分别对微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的卵囊壁进行蛋白组质组学鉴定,蛋白质定性结果显示在微小隐孢子虫卵囊壁阶段鉴定到798种蛋白质,在安氏隐孢子虫卵囊壁阶段鉴定到1032种蛋白,分别占整个预测蛋白组的20%（798/3876）和26%（1032/3876）。基于试验中鉴定到的蛋白质组学数据结果,结合系统的生物信息学预测分析,包括蛋白功能注释、亚细胞定位、COG/KOG功能分类以及蛋白功能富集,并且对所有差异表达蛋白进行了功能分类、功能富集。在微小隐孢子虫卵囊壁组分和安氏隐孢子虫卵囊壁组分中都发现了大量的核糖体和蛋白酶体相关蛋白的表达,表明核糖体和蛋白酶体在隐孢子虫脱囊过程中的重要作用。此外,本研究在微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁提取物中均鉴定出一系列经典卵囊壁蛋白（COWP1-9）,从而验证了本试验所用的纯化和提取方法。3.微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫卵囊壁相关蛋白的克隆表达与定位通过蛋白质组学数据和隐孢子虫卵囊壁结构特性,本研究分别筛选出由cgd7₅140基因编码的微小隐孢子虫富含半胱氨酸基序的表面蛋白和由cand₀20680基因编码的富含半胱氨酸结构域的安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白,推测这两种蛋白可能是位于隐孢子虫卵囊壁表面,可以用来作为体外检测潜在靶标蛋白。本研究根据NCBI公布的基因序列,针对性的设计特异性引物,采用PCR扩增Cpcgd7₅140和Cacand₀20680基因,构建完成重组克隆质粒和表达质粒后进行原核表达。最终两个重组目的蛋白均以包涵体形式表达,目的蛋白通过高浓度尿素和脱盐柱结合的方法进行纯化,最终纯化得到高浓度蛋白Cpcgd7₅140-GST蛋白（1.98mg/mL）和Cacand₀20680-GST蛋白（2.02mg/mL）,可用于后续蛋白定位试验。将最终纯化的重组目的蛋白做为抗原,免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,得到的anti-Cacand₀20680（1.56mg/mL）和anti-Cpcgd7₅140（1.50mg/mL）抗体效价均≥512K。为了进一步验证体外表达的目的蛋白分别在微小隐孢子虫卵囊和安氏隐孢子虫卵囊上的表达定位,本研究采用间接免疫荧光法对目的蛋白进行定位发现,Cacand₀20680重组蛋白定位于安氏隐孢子虫卵囊壁,卵囊壁周围观察到特异性红色荧光;Cpcgd7₅140重组蛋白定位于卵囊表面,在卵囊表面可观察到特异性红色荧光,两种重组蛋白制备的多克隆抗体均有较好的免疫荧光效果。由此推测,Cacand₀20680蛋白和Cpcgd7₅140蛋白分别可以作为安氏隐孢子虫和微小隐孢子虫的体外检测靶标。