论文部分内容阅读
尿酸(Uric Acid,UA)是嘌呤代谢的终产物。当其在人体内生成过多或者排泄减少时,会使血清中的尿酸含量过高,形成高尿酸血症(Hyperuricemia)和痛风(Gout)。目前针对高尿酸血症及痛风的主要治疗手段是利用药物抑制尿酸生成和促进尿酸排泄。然而,药物治疗易引发急性痛风并存在效果不明显、超敏、耐药等缺点,急需一种新的治疗手段来治疗高尿酸血症,减轻患者的痛苦并降低引发其他疾病的风险。合成生物学中利用基因回路设计思想,将各种功能元件进行组装,自下而上的形成功能回路,实现研究人员的设定目标。本研究中我们将尿酸感应元件组装成基因回路,利用基因治疗中所提供的慢病毒载体,将人脐带间充质干细胞作为载体细胞,期望实现基因回路在动物水平上对血清尿酸的调控。本研究主要包括以下几个方面:(1)从GenBank中查得调控元件mUTs、hucO8以及smUox的序列,利用内部核糖体结合位点IRES序列进行串联,形成2,700 bp左右的基因回路mUTs-IRES-huc08-smUox(简称MHS),并对其进行全基因合成。酶切鉴定结果表明成功构建pIRES2-EGFP-MHS载体。研究通过在细胞水平上对尿酸酶的表达、环境中尿酸浓度的变化来评价MHS的调控功能。随后建立大鼠高尿酸模型,通过含基因回路的细胞治疗,在动物水平上对其调控功能进行评价。(2)基因回路导入间充质干细胞需要借助高效、安全的慢病毒载体。以pIRES2-EGFP-MHS载体为模板,PCR钓取目的基因序列,用In-fusion的方法成功构建慢病毒表达载体LV-MHS。利用对照慢病毒LV-EGFP载体,分别从转染试剂、脂质体与DNA比例、转染培养基、病毒收获培养基以及表达质粒与辅助质粒之间的比例等条件来确定慢病毒包装的最佳条件。最终确定的慢病毒最佳包装条件为:选用Lip3000作转染试剂,脂质体与DNA比例(μL:μg)为1.5:1,包装质粒LV-EGFP:pGP:pVSVG的摩尔比例为1:1:1,此外,在转染前2h和转染后6 h,需要分别更换一次含有10%FBS的完全培养基。(3)采用最佳包装条件分别对对照慢病毒LV-EGFP、目的慢病毒LV-MHS进行包装,超速离心法浓缩纯化病毒上清液,并利用荧光观察法检测滴度。最终检测结果表明包装所得的LV-EGFP滴度为4× 108 TU/mL,目的慢病毒LV-MHS滴度为2×106 TU/mL。(4)采用组织块分离的方法从人脐带中分离间充质干细胞,扩增培养后后分别从细胞形态、成骨成脂分化特性以及表面标记检测三个方面进行鉴定。(5)使用滴度为2× 106 TU/mL的对照慢病毒分别从添加感染增强液Enhance、添加助感染试剂Polybrene、增加感染体积以及重复感染等方式对慢病毒感染间充质细胞的条件进行优化。结果显示,在完全培养基中添加10 μg/mL Polybrene,使用60 μL滴度为2×106 TU/mL的对照慢病毒连续感染3次,可以对间充质干细胞产生较好的感染效果。(6)采用最佳感染条件使用目的慢病毒LV-MHS感染MSCs。显微镜下可以观察到成功感染的细胞,感染效率达到10.7%。在此条件下,添加1000 μM尿酸48 h后可以将培养基中的尿酸有效降低至817 μM左右,尿酸清除率达到1 8.23士3.39%。本研究以合成生物学的基因回路原理为基础,结合基因治疗和干细胞治疗,旨在为高尿酸血症提供一个新的治疗思路。构建含尿酸调控基因回路的表达载体,并分别从细胞和动物水平上评价其对环境中尿酸的调控作用。构建含基因回路的慢病毒表达载体LV-MHS,确立最佳的慢病毒包装条件及对MSCs的最佳感染条件。最终实现目的慢病毒LV-MHS对MSCs感染效率为10.7%,能将环境中的尿酸浓度从1000μM降低至817 μM左右,尿酸清除率达到18.23±3.39%。本研究实现基因回路到间充质干细胞的有效递送,并初步探究其在MSCs中对尿酸的调控作用用,从而为基因回路动物水平上对尿酸的调控奠定基础。