目的:研究用Ⅳ型胶原差速粘附法分离、纯化的人表皮干细胞为种子细胞、脱细胞羊膜为支架在体外构建复合皮肤进而移植修复兔背全层皮肤缺损创面,观察创面修复情况,探讨其在创面修复中的作用,为其进一步的临床应用奠定基础。方法:取烧伤整形患者植皮手术剩余皮片标本,经胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原差速粘附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成的人表皮干细胞培养基进行体外培养。观察细胞形态及生长情况、计算其克隆形成率。均以角质细胞作对照。在体外将分离、纯化的人表皮干细胞种植到脱细胞羊膜上,构建成人表皮干细胞脱细胞羊膜复合皮。在新西兰白兔背部制作全层皮肤缺损模型并随机分组,分别用表皮干细胞羊膜复合皮、脱细胞羊膜移植覆盖,以空白创面对照,观察全层皮肤缺损创面愈合情况。各组分别于术后1周、2周、3周、4周在部分创面取材行常规HE染色,免疫组织化学染色,观察各组创面愈合过程中的组织结构改建情况。结果:经Ⅳ型胶原差速粘附法分离、纯化的人表皮干细胞,倒置相差显微镜观察见细胞呈明显克隆性生长并逐渐融合,其克隆形成率与角质细胞的克隆形成率分别为11.67%和4.67%,组间比较差异有显著性意义(P<0.05)。透射电镜观察见细胞胞核大,胞浆少,核浆比例大,胞浆内细胞器少。用人表皮干细胞脱细胞羊膜复合皮、单纯羊膜移植覆盖修复兔背全层皮肤缺损创面,以空白创面为对照。术后创面愈合时间分别为:13.78±1.06d、20.89±1.28d、28.67±1.37d,组间比较差异有显著性意义(P<0.05)。术后创面愈合时的创面收缩率分别为:22.6±1.54%、29.3±1.41%、30.4±1.58%,组间比较人表皮干细胞羊膜复合皮组与单纯羊膜组和空白对照组间的差异有显著性意义(P<0.05),单纯羊膜组与空白对照组组间比较差异无意义(P﹥0.05)。常规HE染色观察创面的改建情况显示:表皮干细胞羊膜复合皮组创面术后7天,表皮细胞层较薄,表皮真皮连接界面平坦,皮钉不明显,真皮层中梭形成纤维细胞排列紊乱;术后14天,表皮细胞层增厚,细胞分层明显,出现角质细胞层、颗粒细胞层、棘细胞层和基底细胞层,出现少量皮钉,真皮层梭形成纤维细胞排列与表皮层平行。单纯羊膜组和空白对照组创面的改建则均较晚,同一时间点创面组织的改建没有表皮干细胞羊膜复合皮组完善。免疫组织化学染色观察显示表皮干细胞羊膜复合皮组创面表皮细胞层CK19、HLA-DR术后7天有阳性表达。Ⅳ型胶原术后14天在基底细胞周围呈线性表达、较连续。单纯羊膜组创面和空白对照组创面表皮细胞层CK19、HLA-DR术后7天表达阴性,Ⅳ型胶原术后14天有部分阳性表达,不连续。结论:休外构建的表皮干细胞羊膜复合皮移植修复兔背全层皮肤缺损创面时,能加速创面愈合,缩短创面愈合时间;创面愈合时的创面收缩率小。术后不同时间点创面组织常规HE染色和免疫组织化学染色示全层皮肤缺损创面上皮化快,真皮层梭形成纤维细胞排列有序化快,创面表皮层能检测到人表皮干细胞存在。提示表皮干细胞羊膜复合皮上的表皮干细胞在全层皮肤缺损创面修复过程中有可能自主参与皮肤缺损的修复,加速创面的愈合和改建。