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结核病(Tuberculosis,TB)是严重危害人类健康的主要传染性疾病,在本世纪仍然是全球关注的公共卫生和社会问题。从使用抗结核药治疗开始,就出现了有关结核耐药的报道,但是并没有引起人们足够的重视。近年来,由于耐多药结核病(Multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)导致的死亡率不断上升,研制有效的抗结核药物已迫在眉睫。维拉帕米(Verapamil,VP)是一种苯烷胺类钙通道阻滞剂,是L-型钙通道(L-type calcium channel,LTCC)的特异性阻滞剂,与LTCC的α1亚基受体结合,降低钙通道的开放率。在临床上,它主要用于心血管系统疾病的治疗。近年来研究发现维拉帕米在肺结核的联合化疗中显示出潜在的治疗价值,它能增强化疗的效果,缩短疗程,并降低耐药率,也有充分的研究数据表明LTCC是一个极具前景的抗结核药治疗靶点,已成为一个新药研究方向。本研究应用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-Polymerase chain reaction,RT-PCR)半定量技术检测巨噬细胞在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染情况下,巨噬细胞(Macrophage,MΦ)钙通道表达变化的规律,并研究维拉帕米对巨噬细胞免疫功能的影响。了解M.tb感染的巨噬细胞在不同浓度的维拉帕米作用下,促炎基因表达和炎性相关细胞因子的分泌情况。一、结核分枝杆菌感染巨噬细胞钙通道的表达将56只小鼠随机分为七组,每组8只,用M.tb强毒株H37Rv、弱毒株H37Ra、卡介苗(Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin,BCG)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)分别感染小鼠24小时后,腹腔灌洗收获巨噬细胞,用RT-PCR半定量技术检测巨噬细胞LTCC mRNA的表达,结果显示M.tb感染后巨噬细胞LTCC在基因水平表达增加,与正常对照组和S.aureus感染组相比差异显著(p<0.05),金黄色葡萄球菌感染的巨噬细胞ltcc在基因水平表达与正常对照组相比无显著变化(p>0.05)。二、维拉帕米对巨噬细胞免疫功能的影响将60只小鼠随机分为两组,一组为正常对照组,另一组为m.tbh37rv感染组,饲养24小时后进行腹腔灌洗收获巨噬细胞,将收获的正常组和感染组巨噬细胞均随机分为9组,分别加入浓度为0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml的维拉帕米,培养细胞24小时后,收集细胞,提取rna,应用rt-pcr半定量技术检测巨噬细胞il-12和核因子-κb(nuclearfactor-kappab,nf-κb)的mrna表达水平。收集巨噬细胞培养上清液和细胞裂解液,通过elisa方法检测巨噬细胞培养上清中细胞因子il-12(p40)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,tnf-α)、il-1β和细胞裂解液中nf-κbp65(ps536)、nf-κbp65(total)含量。结果显示:与无维拉帕米作用的正常组比较,感染组巨噬细胞il-12和nf-κbmrna表达水平显著增高(p<0.05),巨噬细胞培养上清中il-12(p40)的含量和巨噬细胞裂解液中nf-κbp65(ps536)、nf-κbp65(total)的含量也显著增高(p<0.05);当加入的维拉帕米在一定浓度范围内,感染组巨噬细胞il-12和nf-κbmrna的表达、巨噬细胞培养上清中il-12(p40)的含量和巨噬细胞裂解液中nf-κbp65(ps536)、nf-κbp65(total)的含量是增加的,当维拉帕米浓度≥50μg/ml时,这些基因的表达和细胞因子的分泌与无维拉帕米作用的正常组相比,无显著差异(p>0.05)。与无维拉帕米作用的正常组相比,感染组分泌的il-1β和tnf-α水平都显著增高(p<0.01)。感染组分泌的il-1β和tnf-α随着维拉帕米浓度的增加呈剂量依赖性递减。当维拉帕米的浓度≥25μg/ml时,感染组il-1β和tnf-α与无维拉帕米作用的正常组相比,无明显差异(p>0.05)。维拉帕米对正常细胞的细胞因子分泌影响较少。上述结果表明,在m.tb感染情况下,巨噬细胞的ltcc表达增加,il-12和nf-κb无论在基因水平还是在细胞水平表达都显著增加,il-1β和tnf-α的分泌也显著增多。一定浓度范围内的钙通道阻滞剂维拉帕米作用于巨噬细胞,其il-12和nf-κb无论在基因水平还是在细胞水平都随着维拉帕米浓度的升高而增加;但IL-1β和TNF-α的分泌随着维拉帕米浓度的升高而降低,且IL-1β和TNF-α的降低有剂量依赖性。可见,钙通道阻滞能影响感染巨噬细胞的免疫能力。