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LIGHT是一个新发现的TNF超家族成员，又名TNFSF-14或HVEM-L，为一29kD的II型跨膜糖蛋白，多以三聚体的形式诱导表达于活化的T细胞和选择性表达于未成熟树突状细胞上，是一个多功能多效应分子，根据靶细胞上表达的受体与T细胞所分泌的细胞因子的不同而启动不同的生物学效应。目前发现LIGHT有三个受体：HVEM/TR2、LTβR和TR6/DcR3，均为TNFR超家族成员。其中HVEM/TR2组成性表达在未致敏T细胞表面，且在T细胞活化后表达水平有所下调；而LTβR只表达于基质细胞等非淋巴细胞以及一些肿瘤细胞的表面；TR6/DcR3则是缺乏跨膜区的一种可溶性的FasL诱饵受体，主要由胃、脊髓、结肠、淋巴结和脾脏以及肺和结肠来源的肿瘤细胞表达，而外周血淋巴细胞不表达。LIGHT-HVEM相互作用为T细胞的活化提供一个非CD28依赖性的共刺激信号，参与激活特异性CTL反应并诱导以IFN-γ和GM-CSF为代表的Th1型细胞因子分泌；LIGHT-LTβR相互作用通过接头蛋白TRAF激活死亡信号通路诱导肿瘤细胞的凋亡；TR6则作为可溶性诱饵受体通过竞争LIGHT配体，干扰或阻断LIGHT-HVEM及LIGHT-LTβR所引发的生物学效应，从而对免疫应答和免疫自稳进行调节，并可作为肿瘤的免疫逃逸手段之一发挥作用。现有研究发现LIGHT在淋巴器官的发生、肿瘤免疫、自身免疫病、移植排斥反应和抗病毒免疫中均发挥重要的作用。因为LIGHT兼具共刺激和细胞毒两方面的活性，有强大的抗肿瘤潜力，所以它很快成为免疫学研究的热点分子之一。为了深入探讨LIGHT的抗肿瘤机制及其它生物学功能，本研究拟克隆、构建并表达获得具有生物学活性的可溶性LIGHT-Fc蛋白分子，其意义在于：一方面，可溶性的<WP=12>LIGHT-Fc结合受体后，在体内即可发挥诱导肿瘤细胞凋亡及对T细胞的共刺激活性，进而用于肿瘤免疫治疗，当条件成熟时，可被开发成一种治疗肿瘤的生物制剂；在另一方面，获得纯化的可溶性LIGHT-Fc蛋白，为进一步探讨LIGHT在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制以及探索LIGHT的其它生物学功能奠定了坚实的基础。本研究主要进行了以下三部分的工作：1. 人LIGHT全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及LIGHT-Fc的真核表达载体的构建。⑴ 采用PCR技术，从来自活化正常人T细胞的cDNA文库phAD.CAD扩增出编码人LIGHT全长240aa的cDNA序列，装入克隆载体后，经Amp抗性和蓝白斑筛选获得阳性重组子后，经测序证实同公布的LIGHTcDNA序列基本一致，编码氨基酸完全一致；⑵ 将全长LIGHT的cDNA片段从克隆载体上用EcoRI切下来，装入EcoRI线性化的真核表达载体pCI-neo和pcDNA3中，酶切鉴定出正向插入的阳性重组子，为从细胞水平研究LIGHT的功能奠定了基础；⑶ 应用SOE技术构建了带外源信号肽的重组LIGHT融合分子，并与hIgG1Fc一起装入真核表达载体pCI-neo和pcDNA3中，测序证实成功构建了LIGHT-Fc的真核表达载体，为进一步获得LIGHT-Fc融合蛋白打下了基础。2. LIGHT-Fc蛋白的表达，纯化。⑴ 用脂质体法瞬时转染哺乳动物细胞，夹心ELISA证实有融合蛋白的表达；⑵ 蛋白A亲和层析纯化LIGHT-Fc蛋白，并用SDS-PAGE初步确定其单体的分子量和纯度。3. 纯化LIGHT-Fc蛋白的生物学活性研究。⑴ 以A375，MCF-7，Hela和A549细胞为靶细胞，MTT法检测发现LIGHT-Fc蛋白对前三者有直接的生长抑制效应，而A549可能由于表达可溶性诱饵受体TR6，封闭了LIGHT对A549的直接细胞毒效应，从而发生<WP=13>免疫逃逸。总之，初步证实了LIGHT-Fc蛋白对肿瘤细胞的细胞毒效应。⑵ 夹心ELISA法检测了LIGHT-Fc蛋白对纯化人外周T淋巴细胞的共刺激效应，并能诱导IFN-γ等Th1型细胞因子的分泌。