干扰素基因刺激蛋白(Stimulator of interferon gene, STING)是双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)诱导机体产生天然免疫反应的重要信号转导蛋白,在dsDNA的刺激下,STING可介导细胞产生Ⅰ型干扰素(Interferon, IFN)、白介素6(Interleukin 6, IL-6)及IL-1p等细胞因子,从而使细胞发挥抗病毒、抗细菌的作用。作为重要的信号转导蛋白,STING蛋白水平的高低直接影响天然免疫反应强度,研究STING蛋白水平调节机制对于有效调节天然免疫反应强度具有重要意义。以往研究发现,多种细胞分子机制可通过泛素化蛋白酶体降解方式调节STING蛋白水平,进而影响其介导天然免疫反应的强度。在此基础上,我们试图进一步研究STING蛋白的调节机制,该工作也可为进一步丰富DNA天然免疫信号通路提供数据。在本研究中,我们发现质粒DNA转染可诱导MRC-5细胞中STING蛋白表达水平降低,表现出明显的时间效应和剂量效应。另外,除了质粒DNA以外,其他dsDNA,如PCR扩增的dsDNA片段、人基因组DNA、不同的病毒基因组DNA都可诱导STING蛋白水平的降低,说明STING蛋白水平下降是dsDNA转染的一个普遍现象。不同长度DNA片段检测结果显示,短于1000bp的DNA片段不能诱导STING蛋白水平的降低。为研究STING蛋白降解的生物学效应,我们对STING蛋白与维甲酸诱导基因I (Retinoic acid inducible gene I, RIG-I)、 IL-6以及IFN-β之间的关系进行研究。首先,研究下调STING蛋白水平对这三个分子表达水平的影响。利用STING特异性的siRNA (siSTING)下调STING蛋白水平可显著降低RIG-I的表达,首次发现RIG-I除了可作为RNA或DNA感受器外,还可作为STING蛋白激活的下游分子。与已有研究结果相同,下调STING蛋白水平可降低IL-6和IFN-p的表达,以上研究表明这三个分子都是STING激活的下游分子。其次研究RIG-I、IL-6和IFN-β是否参与调节STING蛋白的降解,结果发现：1)利用RIG-I特异性的siRNA(siRIG-I)下调RIG-I表达,可部分提高STING蛋白水平,首次发现RIG-I可反向诱导STING蛋白的降解；2)利用IL-6抗体处理细胞,阻断IL-6的功能,可使STING蛋白水平略有上升,提示IL-6也在一定程度上参与STING蛋白的降解；3)外源加入IFN-β不能降低STING蛋白水平,提示IFN-β本身可能不参与调节STING蛋白的降解。最后研究RIG-I、IL-6和IFN-β之间以及与STING蛋白的相互关系,结果发现外源加入IFN-β可显著提高RIG-I的表达,提示RIG-I和IFN-β是同一信号通路上的两个分子,RIG-I是IFN-β激活的下游分子。单独加入IFN-β可诱导RIG-I表达,但不能诱导STING蛋白的降解,说明RIG-I单个分子不能启动STING蛋白的降解。同时,siRIG-I与IL-6抗体共同作用可进一步抑制STING蛋白的降解,提示RIG-I与IL-6在诱导STING蛋白降解效应上具有协同作用,也同样说明STING蛋白的降解需要多个分子共同作用。总之,STING的激活可以明显增强RIG-I、 IL-6和IFN-β的产生,而持续的RIG-I、 IL-6以及IFN-β增高又会诱导STING蛋白的降解,说明这是宿主细胞为了避免过强免疫反应所采取的一种负反馈调控机制。为研究STING蛋白的降解机制,利用蛋白酶体抑制剂Bortezomib共处理质粒转染细胞并利用免疫共沉淀法检测发现,STING蛋白的降解依赖于泛素化-蛋白酶体途径。然而,特异性下调泛素化E3连接酶RNF5的表达,不能抑制STING蛋白的降解,排除了RNF5作为STING蛋白降解的泛素化E3连接酶的可能。在泛素化位点研究上,诱导突变STING蛋白上所有的赖氨酸残基均不能抑制STING蛋白的降解,说明STING蛋白的降解可能发生了非常规的泛素化修饰。另外,特异性下调干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes, ISG) ISG15蛋白水平,可进一步促进STING蛋白的降解,提示蛋白降解同时受到泛素化和ISG化两种修饰的反向调节。为验证其他细胞是否也存在STING蛋白降解的负反馈调控机制,对人二倍体细胞(2BS和KMB17)、脐带间充质干细胞及部分肿瘤细胞或永生化细胞系(NCI-H358, Hela、HEK293、 NCI-H1703和BEAS)进行检测,在质粒DNA的刺激下,除HEK293、NCI-H1703外,其他细胞均可检测到STING蛋白的降解和RIG-I、IL-6的升高,表明该调控机制在各类细胞中普遍存在,而部分肿瘤细胞或永生化细胞系缺少该调节机制。该项研究揭示了宿主细胞为避免产生过强免疫反应所采取的一种负反馈调控机制,进一步丰富了DNA诱导天然免疫反应的通路研究。