论文部分内容阅读
目的子宫内膜癌是女性生殖道肿瘤发病率最高的恶性肿瘤之一,近年来由于女性寿命延长,高龄及肥胖女性增加,发病率逐年上升。长期以来对子宫内膜癌的病因学研究一直是重点。但目前为止,子宫内膜癌发生的确切机制仍不清楚。近来有关研究证实RNA结合蛋白(RNABPs) HuR在介导肿瘤细胞发生、发展方面发挥重要作用。HuR,是胚胎致死异常视觉(embryonic lethal abnormal vision, ELAV)家族的一员,作为RNABPs,能通过结合并且稳定在3’非翻译区(UTR)中富含A,U (AREs)的片段,发挥其mRNA的转录后调控作用。编码细胞因子、淋巴因子及原癌基因的一类早期反应基因(ERGS)mRNA均含有AREs。以往的研究证实,HuR能在多种细胞系中表达,如：卵巢癌、乳腺癌、肺癌等细胞系。子宫内膜癌是一种雌激素依赖性肿瘤。雌激素受体有两型,即ER-a和ER-β,它们同属配体介导的核受体超家族成员。ER水平的改变可以通过调控转录、转录后及表现遗传学水平引起。ER-α的转录后水平的调控,与RNA结合蛋白结合其AREs,编码ER-a mRNA,从而调控ER-a有效的蛋白翻译有关[1-3]。ER 3’UTR是一段4500的核苷酸片段,含有7个AREs,属于AREs分类中的第Ⅰ类,即在富含U区包含1-3个AUUUA拷贝[4]。但在目前的研究中,HuR在子宫内膜癌中的表达情况及其对ER-a作用机制尚不清楚。本实验拟通过细胞免疫荧光检测HuR在Ishikawa子宫内膜癌细胞的表达情况并运过RNAi技术,将构建的HuR siRNA表达质粒转染入Ishikawa细胞,探讨HuR沉默后对子宫内膜癌生物学特性及ER-α蛋白表达情况的影响,初步阐明HuR在子宫内膜癌发病机制中的作用以及与子宫内膜癌发生与发展的关系。方法用细胞免疫荧光方法测定HuR在子宫内膜癌Ishikawa细胞系中的表达、转染前后的变化；用脂质体转染法将构建的HuR siRNA表达质粒转染入子宫内膜癌细胞。用RT-PCR和Western-Blot观察转染24h、48h、72h后子宫内膜癌Ishikawa细胞中HuR mRNA、蛋白的表达及ER-α蛋白表达情况；以及应用流式细胞技术及MTT比色法分别检测转染后子宫内膜癌Ishikawa细胞周期、凋亡及增殖的变化情况。结果1、构建HuR siRNAs并测序,测序结果与设计相符；将设计的三条HuR-siRNA分别转染入子宫内膜癌细胞,HuR-siRNA1、HuR-siRNA2、HuR-siRNA3对Ishikawa细胞中HuR mRNA表达抑制率分别为55.48%、82.81%、67.59%；故将构建的HuR-siRNA2质粒用作后续转染实验。2、HuR免疫荧光结果显示：HuR在Ishikawa细胞的胞核和胞浆中都有表达,但主要表达于胞核中,转染前与转染HuR-siRNA248h相比,HuR荧光强度明显减弱。3、RT-PCR实验中,各泳道中β-actin mRNA条带亮度相似,而转染HuR-siRNA2表达质粒组条带亮度明显弱于空白对照组、脂质体对照组、HuR-siRNA-neg组条带的亮度。空白对照组、脂质体对照组、HuR-siRNA-neg组、HuR-siRNA2 24h、48h、72h转染组细胞中HuR mRNA的相对含量分别为：0.6082±0.01562、0.5965±0.02080、0.5699±0.01390、0.2650±0.01458、0.18014±0.015980.0914±0.054723。转染组24h、48h、72h组与以上三组相比,差异有统计学意义(P＜0.01)：HuR-siRNA-neg组与空白对照组、脂质体对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。4、Western-Blot实验中,转染HuR-siRNA2质粒24h组、48h组、72h组HuR蛋白相对灰度值分别为：0.5053±0.0233、0.2515±0.0155、0.1773±0.0104；HuR-siRNA-neg组、空白对照组、脂质体转染组相比无显著性差异(P＞0.05)。HuR-siRNA224h、48h、72h转染组分别与以上三组相比均具有统计学意义(F=746.595,P＜0.01)。HuR-siRNA2 24h组与空白对照组、HuR-siRNA-neg组、脂质体对照组相比具有统计学意义(P＜0.05)。HuR-siRNA2 48h、72h组与以上三个对照组相比差异具有显著性(P＜0.01)。转染后72h组蛋白抑制率为73.76%。ER-α在空白对照组、脂质体对照组、HuR-siRNA-neg组、HuR-siRNA2 24h、48h、72h转染组细胞中与β-actin相对灰度比值分别为：0.6023±0.0277、0.5912±0.0277、0.5879±0.0277、0.5041±0.0072、0.4100±0.0140、0.2270±0.0189。HuR-siRNA2转染24h与空白对照组、脂质体对照组、HuR-siRNA-neg组相比无统计学意义(P＞0.05),HuR-siRNA2转染48h组与以上三个对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)：HuR-siRNA2转染72h与以上三个对照组相比差异具有非常显著统计学意义(P＜0.01)。HuR蛋白与ER-α蛋白在Ishikawa细胞表达经Spearman等级相关分析说明两者之间存在明显正相关关系(r=0.951,P=0.003)。5、通过MTT检测法,HuR-siRNA2表达质粒转染Ishikawa细胞后,细胞的增值速度随着转染作用时间的延长明显降低,在转染72h增殖抑制最明显,抑制率为34.26%,转染24h组与空白对照组比较差异无显著性(P＞0.05)；转染48h组、72h组与空白对照组比较差异有非常显著性(P＜0.01)；转染96h组与空白对照组比较有统计学意义(P＜0.05)。转染48h、72h组、96h组与HuR-siRNA-neg组比较差异有统计学意义(分别为P＜0.05、P＜0.01、P＜0.05)；各转染组对Ishikawa细胞抑制率分别为15.31%、26.99%、34.26%、19.58%。6、通过流式细胞技术,与转染的HuR-siRNA-neg组相比,HuR-siRNA2组细胞周期中G1期比例增加,G2/M期及S期细胞比例下降。HuR-siRNA-neg组与HuR-siRNA2组细胞凋亡比例分别为0.41%±0.49%、5.09%±1.58%。结论HuR-siRNA2表达质粒对HuR基因表达有沉默作用,初步证实HuR表达下降的同时,ER-α蛋白表达也下降,两者具有明显相关性。HuR基因表达沉默后能抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖,促进其凋亡。HuR在子宫内膜癌细胞的发生和发展中发挥重要的作用。