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砷(As)是一种对人体及其它生物体有毒害作用的致癌物质。水体中的砷,通常以无机态存在,有三价砷As(Ⅲ)和五价砷As(Ⅴ)两种化学价态。As(Ⅲ)的毒性是As(Ⅴ)的六十多倍,因此,将As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ)既能提高脱除砷的效果,又有利于降低含砷废水的毒性。众多氧化法中生物氧化法是当前研究的热点。本论文在高浓度的含砷废水中筛选出了一株菌株,将其命名为AS-01,该菌株对As(Ⅲ)的耐受浓度为500mg/L,然后对其特性进行研究,并针对该菌株不具备高效氧化As(Ⅲ)的性能进行了改造。本论文研究内容主要有以下几方面:
对分离到的AS-01进行形态观察、生理生化分析,结果显示菌株AS-01为细菌,革兰氏染色阴性,短杆状,丛鞭毛,菌体大小为1.0μm×(3.0~4.0)μm。测定该菌株的16SrDNA的序列,并与Genebank中已知的序列对比,AS-01菌株与Pseudomonasputida的16SrDNA序列同源性为99%,用Neighbor-joining方法构建系统发育树,可以初步断定AS-01菌株属于恶臭假单胞菌。
对该株菌产生的As(Ⅲ)氧化酶的酶学特性的研究结果表明:该菌在30℃左右生长速率最高,在25~30℃酶的合成速率最高;该菌株所产As(Ⅲ)氧化酶的最适温度为30℃,最适pH值为6.0左右,该氧化酶稳定性较差。通过不同浓度的亚砷酸钠对菌种进行诱导,结果表明在500mg/L的浓度下菌株产氧化酶效果最佳,比酶活为0.012μmol/min/mgprotein,比其他能氧化As(Ⅲ)的菌株的酶活性要低得多。
通过PCR方法从ThermusthermophilusHB8的质粒pTT27中扩增得到了As(Ⅲ)氧化酶的基因片段TTHB127、TTHB128,然后分别克隆到T载体上,获得了重组质粒。通过对重组质粒进行了限制性内切酶酶切、PCR扩增以及序列测序分析,测序结果与Genebank中的基因序列(YP_145366、YP_145367)碱基完全相同,表明已获得As(Ⅲ)氧化酶基因。合成带酶切的引物,通过PCR扩增出TTHB127、TTHB128,分别连接到双酶切的载体pBBR1MCS-5上,构建出表达载体TTHB127-pBBR-TTHB128。