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随着免疫抑制剂的大量使用,临床上发生深部真菌感染的患者越来越多,而对这些患者的治疗成功与否,很大程度上取决于能否快速检测出入侵的病原菌。目前,已有大量研究通过检测体液中真菌抗原或代谢物来快速诊断深部真菌感染,其中以真菌细胞壁成分—β-葡聚糖检测应用较广。但由于其易受细菌内毒素影响,现行方法存在假阳性高等缺陷,进一步探讨具有较高特异性的真菌检测方法刻不容缓。β-葡聚糖是真菌细胞壁的保守成分,由β-1,3连接的β-D-葡聚糖构成主链,β-1,6连接的葡聚糖随机散在分布为支链所组成,可作为病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns ,PAMPs)被机体细胞表面的模式识别受体识别(pattern recognition receptors,PRRs),从而诱导机体免疫反应,产生抗感染等生物效应。因此,β-葡聚糖是与真菌感染相关的生物学标志物。Dectin-1(Dentritic cell-associated C-type lectin-1)已被确认为粒细胞上β-葡聚糖的主要受体,为一种Ⅱ型跨膜蛋白,包含一个单独的细胞外C型凝集素样糖识别区域(C-type carbohydrate recognition domain, CRD)和胞浆内的一个免疫受体酪氨酸活化样基序区域(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM),可特异性识别β-1,3连接和β-1,6连接的葡聚糖,甚至整个酵母菌颗粒。本研究拟通过构建小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1 CRD的原核表达载体,进行体外融合表达和亲和纯化的方法获得大量Dectin-1 CRD融合蛋白;并进一步观察该可溶性融合蛋白识别常见真菌细胞壁上β-葡聚糖的能力,以评估是否可将其用于真菌感染诊断以提高检测特异性。本研究共分为以下三个部分:(一)小鼠Dectin-1融合蛋白原核表达载体的构建与鉴定:以小鼠腹腔巨噬细胞总RNA为模板进行RT-PCR,获得Dectin-1的细胞外区域,将其连接到原核表达载体pET28a(+)中,获得重组质粒pET28-Dectin-1;再通过菌落PCR挑选阳性重组质粒进行双酶切和DNA测序鉴定;结果显示:重组质粒pET28-Dectin-1测序结果与GenBank相应序列(登录号AF262985)完全吻合,且插入片段读码框与表达载体读码框相一致。说明含有Dectin-1基因CRD片段的pET28-Dectin-1重组质粒构建成功。(二)小鼠Dectin-1融合蛋白的表达、纯化、复性与鉴定:将pET28-Dectin-1重组质粒转入E.coli BL21(DE3)表达菌感受态细胞中,并以空质粒pET28a(+)及未转染质粒的E.coli BL21(DE3)为对照,在不同的温度和时间条件下加入IPTG诱导其表达,经SDS-PAGE确定融合蛋白表达的最佳条件和形式。研究结果显示:重组质粒工程菌表达蛋白于23KD处检测出特异性阳性信号,即小鼠Dectin-1融合蛋白,且该融合蛋白在包涵体中表达量明显高于上清可溶性蛋白。结果提示:pET28-Dectin-1重组质粒在E.Coil BL21表达系统中大量表达小鼠Dectin-1融合蛋白,该融合蛋白主要以包涵体形式存在。收集经IPTG诱导表达后包涵体蛋白,经溶解、纯化、复性,即获得可溶性Dectin-1融合蛋白。(三)小鼠Dectin-1融合蛋白体外识别常见真菌细胞壁β-葡聚糖的初步研究:采用免疫荧光显微镜技术和流式细胞术检测Dectin-1融合蛋白体外结合白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、烟曲霉菌等8中常见真菌细胞壁β-葡聚糖的能力,探讨小鼠Dectin-1原核表达融合蛋白的体外功能。结果显示:该可溶性融合蛋白可以在体外特异地结合真菌细胞壁β-葡聚糖。本研究成功构建了真菌β-葡聚糖受体Dectin-1的胞外识别区基因片段的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,通过初步实验证实该融合蛋白具有识别、结合真菌胞壁β-葡聚糖的功能,为进一步研究相应的真菌检测方法奠定了基础。