干细胞定向诱导分化是当前干细胞研究领域的一个热点问题。骨髓间质细胞(BMSCs)是一类具有多向分化潜能的均质性成体干细胞，在特定诱导条件下可向不同胚层的细胞分化，如：骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、肝细胞等。近年来，向肝系细胞分化的研究越来越受到人们的关注。本实验的前期研究已成功实现了由骨髓间质细胞向肝细胞的诱导分化，证实了肝损伤组织萃取物对骨髓干细胞的定向诱导活性，并初步揭示了肝损伤组织萃取物的分子基础。研究显示，肝损伤组织萃取物内可能包含有骨髓间质细胞向肝细胞定向分化所需的信息分子。然而，上述研究都是以大鼠模型为基础的，研究发现的大鼠肝损伤组织萃取物的生物学活性是否对其他物种也起作用?换言之，大鼠肝损伤组织萃取物的干细胞定向诱导活性是否具有物种广谱性?对于评估肝损伤组织萃取物的潜在应用价值以及是否有进一步研究开发的必要性，无疑具有十分重要的意义。 如上所述，我们已实现了由骨髓间质细胞向肝细胞的诱导分化，并经动物实验证明这些骨髓源肝细胞能够代偿衰竭的肝脏功能，可作为细胞移植和生物反应器研制的细胞源。然而，如何解决免疫隔离问题则是我们必须跨越的技术屏障。文献分析显示，ACA微囊比较适合细胞移植和生物反应器对免疫隔离的要求。因此，能否利用海藻酸钠和壳聚糖等材料成功地制作出ACA微囊、微珠等细胞载体?能否实现微囊/微珠与细胞的成功结合?如何提高微囊/微珠内细胞的存活率并保持其生物活性?若能解决这一系列技术问题，对于细胞移植技术的发展及生物反应器的研制无疑具有十分重要的意义。基于目前的研究现状以及本研究组前期的工作结果，本实验拟采用大鼠肝损伤组织萃取物分别对源自大鼠、人和新西兰兔的BMSCs进行诱导分化，以观察不同物种来源的细胞对大鼠肝损伤组织萃取物的应答能力，从而判断大鼠肝损伤组织萃取物对骨髓间质细胞的诱导活性是否具有物种广谱性。同时，为了解决细胞移植所引起的免疫隔离问题我们初步探索了．ACA微囊/微珠技术，为细胞移植技术的发展及生物反应器的研制做必要的准备。 实验方法： 一、肝损伤萃取物对不同物种BMSCs分化方向的影响： 1.肝损伤大鼠模型的构建及肝组织萃取物的制备选取SD大鼠为实验动物，以2-AAF/CCl4程序构建肝损伤动物模型。取动物肝脏，制备肝组织萃取物。 2.肝组织萃取物生物活性的鉴定以肝组织萃取物作为刺激物对大鼠骨髓间质细胞(BMSCs)进行体外诱导分化实验，根据BMSCs诱导前后的形态学特征以及分子表达谱特征(分化状态)确认肝组织萃取物的生物活性。 3.三个物种BMSCs的获取和培养。 4.利用同批次相同诱导强度的肝损伤萃取物诱导液同时对三个不同物种的BMSCs进行诱导培养。 5.分别在第5、7、10和20天收集诱导中的细胞，并拍照记录下不同时间的形态特征。 6.利用RT—PCR技术分析不同物种在不同诱导时间的分子表达谱。 二、微囊包被技术初步探索： 1.利用自制微囊制备仪制备微载体，在倒置相差显微镜下观察微载体的形态。 2.扫描电镜观察微球和微珠表面超微结构。 3.尝试模拟滚动培养和静置培养载细胞微珠，并观察不同培养方式下微珠内细胞生长活性和细胞形态。 实验结果： 1.三个物种BMSCs在诱导过程中形态学变化十分相似。在诱导的第5天见一部分短梭形细胞变为类圆形细胞(图3—4)，且细胞生长速度明显减慢；诱导第10天，类圆形细胞逐渐变为多角形类上皮样形态，细胞灶状分布逐渐凸显，导第20天，灶状分布的类上皮样细胞十分明显，呈簇状缓慢生长，中央区域细胞多角形明显(人BMSCs变化更为明显)。 2.大鼠、人和新西兰兔BMSCs在肝损伤组织萃取物的诱导下第5天开始表达幼稚肝细胞的标记M2-PK和GST-P，而在继续诱导第20天幼稚肝细胞的标记消失，同时大鼠BMSCs转而开始表达成熟肝细胞标记Albumin；在第10、20天骨髓源性标记BST-1逐渐消失。这种分化迹象从始至终在对照组没有发现，并始终保持骨髓源细胞特有的标志分子BST-1。注：新西兰兔则因基因信息缺乏致数据缺失。 3.微珠/微囊大小均一、平均直径为0.8mm左右，规则圆形，表面光滑，透明，并具有一定强度；载细胞微珠形态大小和表面结构与空载微珠完全相同，但微珠内可见分布均匀的细胞；载细胞微囊为大小均匀，平均直径约为1m，规则圆形，囊壁完整；培养24h后载细胞微囊内壁可见贴壁细胞贴于微囊囊壁生长，贴壁细胞形态与生长活性和培养瓶二维培养细胞基本相同。 4.扫描电镜示：500倍下微球表面凹凸不平伴有圆形突起，突起之间的平坦区为表面平滑的皱褶，100000倍下皱褶表面平滑。壳聚糖外膜的微珠500倍下可见粗糙表面伴有凹凸不平的球形隆起，100000倍下每个大颗粒表面为分布均匀的形状大小均细的珊瑚状或小颗粒结构组成。 5.微珠在静置培养5天后仍保持一定存活率，同种培养方式下，细胞存活率的下降趋势是固定的，滚动培养在短时间内可以保持较高的存活率；使用培养基更适合做静置培养。载细胞微囊静置培养10天后仍保持较强存活率。 结论： 1.使用大鼠肝损伤萃取物同时对大鼠、人和新西兰兔BMSCs的诱导实验发现，三个物种的BMSCs均能对大鼠肝损伤萃取物的诱导刺激作出应答反应，分别在刺激的第5，7，10天表达幼稚肝细胞的分子标志M2-PK和GST-P(新西兰兔BMSCs仅表达M2-PK)。表明大鼠肝损伤萃取物对骨髓干细胞定向分化的诱导活性具有物种广谱性，有必要进一步研究开发。 2.由于诱导实验的各项参数是依据大鼠设定，诱导实验的第20天，仅见大鼠BMSCs表达albumin，人BMSCs未见表达，可能与刺激强度不足或刺激时间不够所致。新西兰兔则因albumin基因信息缺乏致数据缺失。 3.以自制微囊制备仪制作的海藻酸钠微球、ACA微珠和ACA微囊直径在0.8mm左右，大小均一，形状规则，超微结构特点明显，初步达到预期目标。 4.ACA．微珠/微囊与细胞结合实验显示，细胞能在微珠内存活7天左右而在微囊可以存活10天以上。表明ACA微珠和微囊具有较好的半透性，可作为细胞载体。 5.自制微囊制备仪制作的ACA微珠和微囊直径偏大，表面积较小，距实际应用还有距离，需进一步改善。 6.细胞在微珠/微囊内存活时间过短，尚无法满足临床要求，还有较大的提升空间。