论文部分内容阅读
DEAD/H-box家族RNA解旋酶是一类重要的解旋酶，DDX21是DEAD box家族的一员，在正常细胞中主要位于细胞核的核仁中，对细胞RNA加工过程具有重要的作用。此外，DDX21被证实可能调控宿主细胞先天性免疫。在来源于骨髓的树突状细胞(myeloid dendritic cells，mDCs)细胞中，DDX21通过作用于DDX1-DDX21-DHX36-TRIF通路来调控天然免疫。登革热病毒感染后DDX21能够从细胞核迁移进入细胞质进而调控机体的免疫应答。然而，对于DDX21具体如何调控抗病毒天然免疫机制尚不可知。为了探究DDX21调控抗病毒天然免疫的新机制，展开以下研究: 一、DDX21调控病毒刺激所诱导干扰素的产生。为了观察DDX21在抗病毒免疫应答的功能，沉默DDX21基因后感染病毒，以Western blot、TCID50、ELISA和RT-PCR方法鉴定DDX21基因的缺失对病毒复制和干扰素产生的影响，结果表明:DDX21的沉默能够促进干扰素的产生并且抑制病毒的复制。但是DDX21的过表达对干扰素的产生和病毒复制没有显著影响。 二、DDX21在病毒的作用下能够发生切割。为了研究DDX21在病毒感染后蛋白表达的变化，用不同的细胞感染不同的病毒或使用核酸模拟物刺激细胞，以Western blot方法检测，结果表明:内源性和外源性的DDX21在病毒感染和核酸模拟物刺激后均能够发生切割。 三、病毒感染通过Caspase-3/6途径切割DDX21。为了探究DDX21的切割机制，首先利用抑制剂处理病毒感染的细胞。结果显示:Caspase抑制剂z-VAD-FMK能够显著抑制DDX21的切割，通过构建一系列DDX21的缺失和突变真核表达质粒，证实DDX21126位天冬氨酸为其切割位点。通过对其切割位点序列的分析及基因敲除实验验证，证实Caspase-3/6参与了病毒感染诱导的切割DDX21切割。 四、DDX21切割后能够从细胞核迁移至细胞质中。为了观察DDX21在发生切割后是否影响其定位发生变化，以激光共聚焦的方法检测病毒感染后DDX21的定位，证实DDX21在病毒感染后从细胞核迁移到细胞质中，进一步结果证实DDX21的转位依赖于切割。 五、DDX21切割抑制抗病毒先天性免疫通路。为了探究DDX21切割对先天性免疫通路的影响，通过比较DDX21切割与不切割对干扰素产生的影响，结果表明:DDX21切割抑制病毒感染和poly(I:C)诱导的干扰素的产生及下游干扰素刺激基因的表达。 六、DDX21C端结构域结合双链RNA。为了进一步地探究DDX21的切割如何调控干扰素的产生，利用CO-IP和RNA pull down方法检测DDX21与其自身和RNA的互作，结果显示DDX21能够通过其C端结构域与自身和双链RNA互作。 本论文证明DDX21在抗病毒天然免疫中发挥重要的调控作用，更重要的是首次发现DDX21在病毒的作用下发生切割且能够发生迁移，通过与RNA结合调控抗病毒天然免疫。这为进一步的研究DDX21调控抗病毒天然免疫提供理论依据。