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高山被孢霉(Mortierella alpina)是一株高产花生四烯酸的丝状真菌,已被广泛用于工业生产花生四烯酸。目前高山被孢霉的基因组、转录组、脂质组信息已明确,基于上述信息,为进一步解析其产脂积累过程并构建高产脂菌株,单基因与双基因改造手段已不能满足研究需求,而多基因操作系统在高山被孢霉中的构建和应用未有报道。规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统是一种功能强大且应用广泛的靶向基因敲除工具。通过诱导型启动子作用下的CRISPR系统对靶向基因如筛选标记进行反复诱导敲除,可以实现凭借单一筛选标记完成对宿主菌的多基因改造。还原力NADPH是产油微生物产脂过程所必需的成分,对脂质积累影响显著。本论文在高山被孢霉中构建了基于CRISPR系统的多基因表达策略,挖掘并筛选NADPH供应途径中的关键酶,并通过该系统实现了NADPH供应关键基因的导入以及筛选标记的二次回收,证明了该系统在高山被孢霉中的成功应用。本论文主要研究内容和实验结果如下:1.高山被孢霉转化效率的提升。为便于大片段、多目的基因高效导入高山被孢霉,本论文从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的种类(AGL-1、C58C1、EHA105和LBA4404)及高山被孢霉的细胞形态两个方面探索其对高山被孢霉转化方法的影响;其中,在四种根癌农杆菌AGL-1、C58C1、EHA105和LBA4404中,根癌农杆菌AGL-1和EHA105对高山被孢霉的转化效率最高;应用根癌农杆菌AGL-1转化不同细胞形态(新鲜孢子、萌发孢子、液体菌体和固体单菌落)的高山被孢霉,发现萌发孢子作为被转化材料时转化效率最高。2.高山被孢霉中基于组成型启动子的CRISPR系统的构建。为对比CRISPR系统中常用核酸酶Cas9和Cpf1的基因编辑效率,本论文借用优化后的转化方法构建了组成型启动子His550下的CRISPR系统的高山被孢霉重组菌MA-His550-spCas9和MA-His550-LbCpf1,基于学术网站对靶向基因ura5设计sgRNA(针对spCas9)和CrRNA(针对LbCpf1)引导链,在对应的重组菌中进行尿嘧啶ura5基因的靶向敲除,结果显示在高山被孢霉中LbCpf1对靶向基因的敲除效率比spCas9高,被选定用于后续实验。3.高山被孢霉中基于诱导型启动子的CRISPR系统的构建。为操控核酸酶LbCpf1的适时表达以实现尿嘧啶筛选标记的反复回收,本论文首先验证了诱导型启动子cbh1在高山被孢霉中的功能,随后构建了cbh1引导下的靶向敲除筛选标记ura5的重组菌MA-Pchb1-LbCpf1,对其中一株生物量及产脂性状优良的重组菌进行诱导条件优化并获取13株尿嘧啶缺陷型重组菌MA-Pchb1-LbCpf1-ura5~-;对上述13株重组菌进行脂肪酸发酵分析,筛选得到1株生物量高且总脂含量与野生型高山被孢霉无显著性差异的尿嘧啶缺陷型重组菌,本论文至此已成功完成高山被孢霉中基于CRISPR系统的多基因表达系统的构建。4.高山被孢霉中NADPH供应途径的挖掘与筛选。为挑选用于多基因表达系统的基因,本论文从还原力NADPH供应角度对多种途径进行挖掘和筛选,首先在高山被孢霉中通过同源过表达和RNA干扰手段探究了3种潜在的NADPH供应途径的作用,发现三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,EC 1.2.1.12)途径、NAD激酶(NAD kinase,NADK,EC 2.7.1.23)途径和NADH激酶(NADH kinase,NADHK,EC 2.7.1.86)途径在高山被孢霉的产脂过程中能起到NADPH供应作用;随后,综合考量高山被孢霉中已探究NADPH供应途径对产脂积累的贡献,从6种途径中筛选得到用于后续基因操作的苹果酸酶途径基因me1。5.诱导型启动子引导下的CRISPR系统在高山被孢霉中的初步应用。利用筛选得到的MA-Pchb1-LbCpf1-ura5~-重组菌作为出发菌株,借助根癌农杆菌AGL-1,导入苹果酸酶me1基因,得到了3株重组菌MA-Pchb1-LbCpf1-me1;通过摇瓶发酵实验,挑选其中一株产脂性状优良的重组菌进行筛选标记ura5基因的诱导敲除,表型筛选和测序结果表明成功得到了3株尿嘧啶缺陷型重组菌MA-Pchb1-LbCpf1-me1-ura5~-,实现了筛选标记的二次回收。本论文借助诱导型启动子引导下的CRISPR系统,在高山被孢霉中实现了基因导入和筛选标记的反复回收,证明了此系统在高山被孢霉中的成功应用。