研究背景及目的:　　研究背景:基质金属蛋白酶在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥着重要的作用，其合成和分泌失衡有助于肿瘤细胞水解细胞外基质，促进和加速转移的发生。乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一，发病率逐年升高，远处转移是其最主要的死亡原因，而常规的放化疗手段作用有限且都不可避免的伴随有正常组织的损伤，因此寻找能有效的抑制基质金属蛋白酶的天然药物是提高乳腺癌患者生存质量的重要手段。我国传统的中草药在抗肿瘤方面疗效持久且副作用小，越来越受到医学界的重视。罗勒多糖是从香料族全草植物罗勒中提取的药物有效成分，我实验室前期研究发现其对卵巢癌和肺癌均有一定的抑制作用，但是罗勒多糖能否抑制乳腺癌细胞的侵袭及是否通过影响基质金属蛋白酶来抑制侵袭尚无相关研究。因此该研究的目的包括以下几点:①观察罗勒多糖对乳腺癌细胞株MDA-MB-231的侵袭性有无影响。②研究常见的与肿瘤侵袭有关的基质金属蛋白酶:基质金属蛋白酶2、9及膜型基质金属蛋白酶1在MDA-MB-231细胞中的表达及罗勒多糖对它们的影响。③探讨罗勒多糖通过抑制基质金属蛋白酶来影响MDA-MB-231细胞侵袭性的作用机制。　　研究方法:　　1.体外培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞，通过MTT试验确定罗勒多糖对其存活率的影响，以明确下一步试验所用罗勒多糖的浓度将100μLMDA-MB-231细胞悬液（约2×103个）接种到96孔板里培养至细胞贴壁，对照组细胞补加100μL RPMI1640培养基，5个实验组分别加入100μL罗勒多糖溶液（浓度分别为100、200、300、400、500μg/mL）。处理20 h后，每孔分别加入15μL MTT。继续培养4h，弃去上清，每孔加入150μL DMSO，振荡溶解。然后用ELISAplate reader测540 nm光吸光度，校正波长为630 nm。用下而的公式计算细胞的存活率:细胞存活率(％)=（实验孔的平均吸光度/对照孔的平均吸光度）×100％。在不影响MDA-MB-231细胞存活率的罗勒多糖浓度范围内进行后续试验。　　2.在不影响细胞存活率的浓度范围内，通过Transwell小室观察罗勒多糖对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭性的影响体外培养MDA-MB-231细胞生长至70％～80％融合，弃去原培养液，改用无血清培养基饥饿12h。弃去无血清培养基，对照组用RPMI1640培养基、实验组分别加入不同浓度的罗勒多糖溶液处理20 h。用transwell小室检测处理后的对照组和实验组细胞侵袭性的变化。将BD Matrigel TM Matrix（15μg/filter）铺在无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜上形成孔径为8μm的滤膜。下室加入NIH3T3细胞的无血清培养上清。上室加入200μL约含有2×105个细胞的细胞悬液。孵育10h后用棉签擦掉滤膜上面的细胞。滤膜下面的细胞用甲醇固定，再进行HE染色。倒置相差显微镜下随机选取9个视野计数。　　3.RT-PCR法检测罗勒多糖对基质金属蛋白酶2、9及膜型基质金属蛋白酶1基因表达的影响将MDA-MB-231细胞接种到6孔板并培养到80％融合，将细胞在无血清培养基中饥饿12h，对照组用RPMI1640培养基、实验组分别加入不同浓度的罗勒多糖溶液处理20 h。收集细胞，Trizol提取总RNA，应用紫外线分光光度仪计算RNA浓度和纯度。DNAase处理总RNA后，逆转录获得cDNA。取0.8μl cDNA作为模板PCR扩增MT1-MMP、MMP-2、MMP-9。同时扩增β-actin做内参对照。比较罗勒多糖作用前后上述三种基质金属蛋白酶mRNA水平的变化，从中筛选出有变化的指标，进行下一步研究。　　4.酶联免疫吸附法检测罗勒多糖对基质金属蛋白酶2、9分泌的影响将MDA-MB-231细胞接种到6孔板并培养到80％融合，将细胞在无血清培养基中饥饿12h后，对照组用RPMI1640培养基、实验组分别加入不同浓度的罗勒多糖溶液处理20 h。收集上清并离心。取离心后上清液并调整蛋白浓度，根据MMP-2及MMP-9ELISA试剂盒的步骤检测二者的含量。　　5.明胶酶谱法检测罗勒多糖对基质金属蛋白酶2、9活性的影响将MDA-MB-231细胞接种到6孔板并培养到80％融合，将细胞在无血清培养基中饥饿12h，对照组用RPMI1640培养基、实验组分别加入不同浓度的罗勒多糖溶液处理20 h。收集上清并离心。取离心后的含有等量蛋白的上清液进行电泳，电泳结束后经洗脱、漂洗、孵育、染色及脱色后照相并用凝胶图像分析系统分析各条带的光密度值。　　6.Westren blot法检测罗勒多糖对MT1-MMP蛋白表达的影响MDA-MB-231细胞培养至80％融合。饥饿12h后对照组用RPMI1640培养基、实验组分别加入不同浓度的罗勒多糖溶液处理。20 h后收集细胞并提取蛋白。用BCA蛋白分析仪测定蛋白浓度。取等量蛋白进行10％ SDS-PAGE电泳，之后转膜。将膜用脱脂奶粉封闭后，加入MT1-MMP兔抗人一抗（浓度1∶1000）4℃过夜，TBST洗三次后加入小鼠抗兔二抗（浓度1∶2000），室温孵育1h。ECL法(AmershamBioscience，Buckinghamshire，UK)显像，应用Gel-Pro软件定量分析。　　结果:　　1.罗勒多糖浓度不超过300μ g/mL时MDA-MB-231细胞的存活率不受影响采用MTT实验检测罗勒多糖是否影响MDA-MB-231细胞的存活率。结果显示，与对照组相比，罗勒多糖浓度为100、200、300μg/mL时，MDA-MB-231细胞的存活率分别为0.941、0.952和0.927，与对照组相比均没有显著差异（P＞0.05）。而罗勒多糖浓度为400、500μg/mL时则会产生细胞毒作用，细胞存活率分别为0.650、0.568，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，为避免药物浓度过高产生的细胞毒性对实验结果产生影响，后续实验我们使用浓度为100μg/mL和300μg/mL的罗勒多糖进行。　　2.罗勒多糖可以抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力采用transwell小室检测对照组和实验组MDA-MB-231细胞侵袭性的变化，结果显示对照组穿过人工基底膜的细胞数为205，而100μg/mL和300μg/mL罗勒多糖组穿过基底膜的细胞数分别为55和40。可见在不产生细胞毒性的药物浓度范围内，罗勒多糖处理过的MDA-MB-231细胞穿透人工基底膜的能力明显下降，且下降的程度与罗勒多糖的浓度成正比，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　3.罗勒多糖可下调MT1-MMP基因mRNA表达水平，但对MMP-2、MMP-9的基因表达无影响采用RT-PCR检测不同处理组MDA-MB-231细胞三种基质金属蛋白酶:MMP-2、MMP-9及MT1-MMP的基因表达水平的变化。通过电泳条带观察罗勒多糖对MDA-MB-231细胞MT1-MMP及MMP-9的mRNA表达均有抑制作用，但是对MMP-2的mRNA表达无影响。进一步定量分析显示MDA-MB-231细胞株本身MMP-9的mRNA表达水平极低且与对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。而与对照组相比，罗勒多糖处理组MT1-MMP的mRNA表达水平明显下降(P＜0.05)。　　4.罗勒多糖对MMP-2、MMP-9的分泌量无影响用酶联免疫吸附法检测培养上清中MMP-2及MMP-9的含量，从而判断罗勒多糖对二者的分泌有无影响。结果表明对照组及100μg/mL和300μg/mL罗勒多糖组上清液中MMP-2的浓度分别为0.2574 pg/ml、0.2468 pg/ml及0.2653pg/ml， MMP-9的浓度分别为0.1927 pg/ml、0.2137 pg/ml及0.1849 pg/ml实验组与对照组相比均无统计学差异。　　5.罗勒多糖对MMP-2、MMP-9的酶活性无影响采用明胶酶谱法检测不同处理组MDA-MB-231细胞MMP-2及MMP-9酶活性的变化。通过电泳条带观察，与对照组相比罗勒多糖对MDA-MB-231细胞MMP-2及MMP-9活性无影响，进一步定量分析显示实验组和对照组MMP-2及MMP-9的活性无统计学差异（P＞0.05）。　　6.罗勒多糖可以抑制MT1-MMP的蛋白表达收集对照组和实验组细胞并裂解，提取蛋白，应用Western Blotting检测MT1-MMP的蛋白表达。结果显示罗勒多糖处理组MDA-MB-231细胞的MT1-MMP表达水平下调，且下调程度与处理时所用罗勒多糖的浓度成正比。　　结论:　　1.罗勒多糖有抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭性的作用。　　2.生理情况下MMP-2、MMP-9及MT1-MMP在乳腺癌MDA-MB-231细胞系中均有表达，其中MMP-9的表达水平较低。　　3.罗勒多糖作用后MMP-2和MMP-9的表达、分泌及活性无改变，但MT1-MMP的基因和蛋白表达均下降，说明罗勒多糖是MT1-MMP的特异性抑制剂，其抑制MDA-MB-231细胞侵袭的作用是通过抑制MT1-MMP的活性来实现的。