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绿僵菌在害虫生物防治中起重要作用,也已经广泛应用于蝗虫等的防治。罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii,下称绿僵菌)作为昆虫病原真菌的模式生物,在昆虫病原真菌的代谢调控,致病机理,遗传调节机制和生物技术防治研究中起重大作用。多年来,国内外学者致力罗伯茨绿僵菌致病和抗逆的分子机理研究,取得了丰硕的结果;但是作为生防真菌,罗伯茨绿僵菌仍有很多的弱点,如:杀虫速度较慢,易被环境影响等,因此,限制了绿僵菌在生产上的大规模应用。转录组测序可以得到某一种特定组织或者细胞的将近全部转录本和基因序列通过利用二代测序平台,而今,也已广泛应用于真核生物,包括绿僵菌,但罗伯茨绿僵菌的转录组学研究内容较少;且通过利用RNA-Seq技术,可以解决特定的生物学问题,包括可变剪切分析,优化基因结构,新转录本鉴定以及发掘新基因等。为此,本研究以罗伯茨绿僵菌为研究对象,首先在4个不同条件下(包括生长发育、逆境胁迫、侵染定殖以及退化),培养绿僵菌,提取其总RNA,并完成转录组测序;其次,就测序所得转录组数据进行生物信息学分析,对预测的新转录本,完成功能注释;最后,针对从注释的新转录本中筛选到小泛素相关修饰基因(Smallubiquitin-related modifier,下称SUMO),进行基因敲除,通过对敲除突变体和野生型菌株之间的生长表型、抗逆、产孢量和毒力的比较分析SUMO的可能生物学功能。具体研究结果如下:(1)转录组测序分析发现新转录本:研究共获得80,954,892条序列(reads),经过质量过滤,得到46,674,896 clean reads,利用TopHat技术,比对到绿僵菌基因组,得到28,251,957 reads。为了得到新转录本,我们便比对测序所组装的转录本和参考基因组中已有的转录本。本研究中,先对测序所组装的转录本和参考基因组中已有的转录本进行比对,再进一步地预测新转录本。结果发现:共有769个新转录本,其中77个为可编码的新转录本。利用NCBI本地BLAST以及得到的CDS(Coding sequence)数据,针对77个可编码的新转录本进行功能注释,最后筛选出NovelTr 351号新转录本编码SUMO蛋白;已经有大量报道显示:SUMO是与泛素化相类似的蛋白质翻译后修饰的一种方式,SUMO不仅可以对转录因子进行负调控,也可以对其完成激活转录。这些或许正是对环境刺激产生的应答反应,由此可见小泛素相关修饰是一种多功能的蛋白质翻译后修饰,更是至关重要的。它不仅能降解无用的蛋白质,而且参与转录调控,核转运和维持基因组完整性等细胞内活动的修饰,使机体正常运作,甚至避免某些疾病的发生。且有研究表明泛素途径可以增强植物逆境生长能力。因此,本研究进一步选择SUMO对其可能的生物学功能进行深入分析。(2)SUMO的功能分析通过基因敲除,本研究获得了△SUMO(SUMO敲除突变株)以及cp△SUMO(△SUMO回补株)。随后表型分析发现:与野生型菌株和回补株相对比,敲除突变株在PDA培养基上的菌丝生长速率和状态以及对化学物质耐受和毒力,均无差异;但是敲除突变株孢子颜色由墨绿变浅;更进一步的讲,敲除突变株的产孢较为稀薄,且产孢量明显低于野生型和回补菌株,下降了50%,这些结果表明SUMO基因对绿僵菌的产孢过程可能存在调控作用;此外,与野生型菌株和回补株相对比,敲除突变株对高温和紫外的耐受力存在显著差异:高温45°C处理1h,结果发现敲除株较野生型和回补株的孢子萌发率下降35-45%;紫外100μJ/cm~2照射,结果发现敲除株较野生型和回补株的孢子萌发率下降40-50%。这些结果表明SUMO基因对绿僵菌的逆境耐受可能存在调控作用。本研究旨在研究不同条件下绿僵菌的新转录本和SUMO基因的生物学功能,研究结果的获得为进一步分析绿僵菌产孢以及耐高温,耐紫外的抗逆能力和产孢能力提供基础。