【摘 要】
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乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）是一种具有促骨活性的天然铁结合蛋白,目前已成为婴幼儿奶粉母乳化的一个必备指标,然而LF的促骨作用机制尚不完善。本研究利用体外成骨细胞模型和体内动物实验模型,明确TGF-β受体以及维生素D受体（VDR）参与调控LF促成骨细胞的增殖和分化过程,并揭示LF在体内促骨生成的作用机制,为完善LF发挥促骨活性的分子机制提供了新的证据。本研究首先利用免疫共沉淀技术证实了
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乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）是一种具有促骨活性的天然铁结合蛋白,目前已成为婴幼儿奶粉母乳化的一个必备指标,然而LF的促骨作用机制尚不完善。本研究利用体外成骨细胞模型和体内动物实验模型,明确TGF-β受体以及维生素D受体（VDR）参与调控LF促成骨细胞的增殖和分化过程,并揭示LF在体内促骨生成的作用机制,为完善LF发挥促骨活性的分子机制提供了新的证据。本研究首先利用免疫共沉淀技术证实了 TGF-β受体Ⅱ是LF的受体;进而通过慢病毒稳定敲除手段及抑制剂阻断技术抑制TGF-β受体Ⅱ和受体Ⅰ后,LF促成骨细胞的增殖率和碱性磷酸酶（ALP）活性显著降低,确证TGF-β受体参与LF促成骨细胞的增殖和分化过程;然后利用siRNA基因沉默手段沉默受体Ⅱ,对LF促进p-p38的表达量无显著影响,说明TGF-β受体Ⅱ不参与LF对p38通路的激活,另外,抑制受体Ⅰ后,LF对p38通路的激活作用也没用被抑制,表明TGF-β受体虽然是LF促成骨细胞增殖和分化的受体,但并不能介导p38通路发挥其生物活性。为了研究VDR在LF促成骨细胞增殖和分化过程中的作用,本研究分析了在LF刺激下成骨细胞内VDR途径的激活及生理意义。LF刺激MC3T3-E1细胞后,胞内VDR在mRNA水平上升高达30倍,在蛋白水平上VDR的表达也有显著升高,说明LF能激活VDR途径;利用siRNA基因沉默技术阻断VDR表达后,LF的促增殖率和ALP的活性显著降低,说明VDR参与LF促成骨细胞的增殖和分化过程。另外,为了探索LF对VDR高表达的作用机制,通过抑制剂阻断技术抑制TGF-β/Smads和p38通路后,LF对VDR表达的促进作用并无显著性的降低,表明LF对VDR的调控不依赖于胞外途径,进而抑制LF内吞进入细胞后,LF促VDR高表达的作用完全被抑制,说明LF是通过进入细胞发挥作用的。最后,1,25-（OH）2D3存在时,LF对胞浆VDR的促进作用是单独添加LF的2倍,表明LF能作为VDR激动剂协同VD共同调控成骨细胞的增殖和分化过程。基于前面的研究结果,本文推测LF在体内也能作为VDR的激动剂协同VD调控钙代谢促进骨骼健康。为了证实这一猜想,采用钙充足且不含VD的饲料饲喂C57BL/6J小鼠,并分组进行如下干预:VD 缺乏组（灌胃 0、100、1000mg/kg LF）,VD 正常组（灌胃 0、100、1000mg/kg LF）。干预20周后,首先测定各组小鼠血液中钙、磷的含量,结果表明口服LF对血液中的钙磷无显著影响,说明LF能维持血钙保持稳态。通过显微CT检测小鼠股骨远端骨小梁微观结构,证明LF能缓解由于VD缺乏造成的骨密度降低及骨小梁结构的退变,并通过免疫组化和Western blot技术检测骨组织中VDR的表达量在口服LF后有显著上升,表明LF通过VDR途径抑制骨钙释放。另外,口服LF能显著降低尿液中钙、磷的含量,并且在结肠及肾脏中口服LF组的VDR表达量显著上升,表明LF通过VDR途径促进肠道及肾脏对钙的吸收,从而维持血钙的平衡,促进骨骼健康。综上所述,本研究证实了 TGF-β受体能介导LF促成骨细胞的增殖和分化过程,并且LF还能作为VDR激动剂调控钙代谢缓解由VD缺乏造成小鼠的骨密度降低及骨小梁结构退变
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