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目的脑缺血性疾病是严重危害人类生命健康和致残率极高的疾病，脑血管疾病中缺血性脑卒中占绝大部分，对社会和家庭造成沉重的负担，是当前神经科学迫切需要解决的问题。研究表明，在脑缺血急性期，加强神经保护作用，挽救缺血灶半影区和缺血敏感区的神经元、减少缺血神经元死亡等措施对脑缺血的康复非常重要。神经生长因子(NGF)可促进神经细胞存活和再生，对脑缺血损伤有一定的保护和治疗作用。降钙素基因相关肽(CGRP)是一较强的舒血管肽，在脑血液循环中有很强的扩张血管和免疫调节作用，外源性CGRP能显著增加脑血流量，减少局灶性脑缺血梗死灶的体积，对缺血神经元有保护作用，但NGF及CGRP对缺血神经元的作用机制尚不完全清楚。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)是多种信号转导通路的关键调节子，也是细胞内一个重要的信号分子，磷酸化CREB是CREB的活化形式，调节多种基因的表达，CREB在神经保护方面的作用及参与的信号转导机制已成为近年来神经科学领域研究的热点，那么CREB是否参与NGF及CGRP对缺血神经元的保护作用机制尚未见报道。tau蛋白是一种脑特异性的细胞骨架蛋白，具有促微管组装和维持微管稳定、维持神经元的形态和促进轴突运输等重要作用。其功能主要受磷酸化调节，tau蛋白异常过度磷酸化，失去生物学功能，并自身聚合为成对螺旋丝，进而形成AD特征性病理改变——神经原纤维缠结。短暂性脑缺血诱导tau蛋白位点特异性的过度磷酸化，同时流行病学研究发现，缺血性中风患者痴呆的发生率比对照组高许多倍，说明tau参与脑缺血的病理生理机制，因此对tau蛋白水平的干预可能成为脑缺血治疗的靶点。NGF及CGRP对缺血神经元的作用机制是否通过对tau蛋白磷酸化水平的干预来实现尚待进一步研究。实验方法1、实验动物的分组健康雄性Wistar大鼠146只，随机分为5组：(1)假手术对照组(Sham组，n=31)；(2)缺血再灌注模型组(I/R组，n=31)；(3)NGF处理组(n=28)；(4)CGRP处理组(n=28)；(5)NGF & CGRP合用组(n=28)。各组又分假手术后或再灌注3h、12h、24h、48h、72h 5个时间点。2、局灶性脑缺血再灌注模型的制备用线栓法阻塞大鼠右侧大脑中动脉制作脑缺血再灌注模型，动物清醒后按Longa法进行神经功能评分，本研究选取1、2、3分者作为成功模型。缺血2小时后轻轻拔出栓线以实现再灌注。I/R组、NGF组、CGRP组、NGF&CGRP组在再灌注同时用微量注射泵从右颈总动脉分别注入1 ml的生理盐水、NGF(1000U/kg，)、CGRP(3μg/kg)、NGF&CGRP(NGF，1000 U/kg；CGRP 3μg/kg)，速度2 ml/h。3、TTC染色假手术组与I/R组大鼠于24 h时间点随机各取3只，断头取脑作冠状切片，放于TTC溶液中染色，后固定，拍照。4、组织切片的准备以上各组动物分别于再灌注不同时间点，用多聚甲醛灌注固定，取脑，作连续脑冠状冰冻切片。5、HE染色观察海马组织病理学变化大鼠脑切片行常规HE染色，光镜下观察比较各组大鼠再灌注24 h的海马组织病理学变化。6、Nissl染色，计数右侧海马CA1区每个视野下神经元数目。7、采用CREB、tau原位杂交检测试剂盒检测切片CREB mRNA、tau mRNA的表达。8、免疫组织化学染色检测CREB与p-CREB表达。9、免疫组织化学染色检测p-tau(Ser199/202)与tau-5表达。10、原位杂交和免疫组织化学切片图像分析与统计学处理。定量分析各组大鼠右侧海马CA1区CREB mRNA、CREB蛋白和p-CREB以及tau mRNA、p-tau(Ser199/202)和tau-5阳性反应物的平均光密度值，用SPSS10.0统计软件作统计分析，样本均数间比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。11、Western blot检测海马CREB和p-CREB的表达、图像分析及数据处理。12、Western blot检测海马p-tau(Ser199/202)与tau-5的表达、图像分析及数据处理。实验结果1、动物行为学观察按Longa法神经功能评分为1～3分的动物表现有明显神经功能受损症状，假手术动物评分为0分。2、TTC染色结果TTC染色发现缺血再灌注组右纹状体外侧及皮质外侧有明显的缺血灶，该区域为大脑中动脉供血区，假手术动物脑无缺血灶，证明模型制作成功。3、切片组织病理学观察与Nissl染色细胞计数HE和Nissl染色可见假手术组右侧海马结构清晰，CA1区神经元数量多，胞浆中尼氏体清晰可见。在缺血再灌注24 h组，右侧海马CA1区神经元中出现了一些缺血样改变，正常神经元数量减少。NGF组、CGRP组海马CA1区存活神经元数比缺血再灌注组增多，细胞形态明显改善，NGF与CGRP合用组海马CA1区存活神经元数进一步增多。4、CREB原位杂交染色及定量分析结果假手术组海马CA1区CREB mRNA有明显表达，缺血再灌注组CA1区CREBmRNA阳性反应产物平均光密度值低于假手术组，NGF组和CGRP组的CREBmRNA表达高于缺血再灌注组，NGF&CGRP组CREB mRNA表达分别高于NGF组和CGRP组(P<0.05)。5、CREB和p-CREB免疫组化染色及定量分析结果假手术组海马CA1区CREB有明显表达，缺血再灌注组CA1区CREB阳性反应产物平均光密度值低于假手术组，NGF组和CGRP组的CREB表达均高于缺血再灌注组，NGF&CGRP组的CREB阳性反应产物分别高于NGF组和CGRP组(P<0.05)。Sham组CA1区p-CREB表达较少，I/R组p-CREB的表达明显高于sham组，NGF组和CGRP组CA1区p-CREB的平均光密度值均大于UR组和sham组，NGF&CGRP组p-CREB表达分别高于NGF组和CGRP组(P<0.05)。6、Western blot检测海马CREB和p-CREB的表达结果Western印迹显示在相对分子量43kD处I/R组CREB的积分光密度值(IDV值)比sham组小，而NGF组和CGRP组海马CREB的IDV值高于FR组，NGF&CGRP合用组CREB表达进一步升高(P<0.05)。UR组p-CREB的IDV值高于sham组，NGF组和CGRP组p-CREB的IDV值均高于Sham组和I/R组，NGF&CGRP组p-CREB表达最高，分别高于NGF组和CGRP组(P<0.05)。7、p-tau(Ser199/202)和tau-5免疫组化染色及定量分析结果19-tau在Sham组有表达，在缺血再灌注3 h明显增加，到12 h、24 h进一步升高后逐渐下降，到72 h仍高于对照组水平(P<0.05)；NGF及CGRP明显降低缺血再灌注海马神经元的p-tau(Ser199/202)免疫反应性，NGF与CGRP合用进一步降低缺血再灌注海马神经元p-tau(Ser199/202)表达(P<0.05)。缺血再灌注组tau-5阳性神经元的平均光密度在各时点均高于假手术组；NGF组和CGRP组tau-5反应阳性产物的平均光密度值均低于缺血再灌注组(P<0.05)，NGF与CGRP合用明显降低缺血再灌注海马tau-5反应性，但与单独使用NGF或CGRP组相比，差异无显著性。8、Western blot检测海马p-tau(Ser199/202)和tau-5的表达结果缺血再灌注组p-tau免疫印迹IDV值较假手术组增高；NGF组和CGRP组p-tau条带光密度值比缺血再灌注组减少，但高于假手术组；NGF与CGRP合用组p-tau条带光密度值进一步降低，分别低于I/R组和NGF、CGRP组(P<0.05)。tau-5在I/R组表达增多，NGF、CGRP处理后tau-5表达减少，低于缺血再灌注模型组(P<0.05)，NGF与CGRP合用处理后海马tau-5表达比缺血再灌注模型组减少，但与NGF组、CGRP组比较无明显变化。9、tau原位杂交染色结果tau mRNA阳性反应产物呈棕黄色，多位于胞浆，细胞核也有着色，各组大鼠海马CA1区tau mRNA均有明显表达，且表达的强弱相近，无明显变化。结论1、NGF及CGRP改善局灶性脑缺血再灌注大鼠海马神经元形态，二者促进缺血神经元的恢复可能是通过上调海马神经元内CREB mRNA及其蛋白的表达、激活CREB来实现的，激活CREB可能是NGF及CGRP保护缺血神经元的重要分子机制之一。2、NGF及CGRP减轻局灶性脑缺血再灌注大鼠海马tau蛋白磷酸化程度，并下调tau-5蛋白的表达，而对tau mRNA影响不大，抑制tau蛋白磷酸化水平可能是NGF及CGRP保护缺血神经元的又一重要分子机制。3、磷酸化CREB和tau可能是NGF和CGRP作用于缺血神经元的信号通路交汇点，二者通过一系列信号转导通路协同性地保护缺血神经元，联合应用作用更强。4、CREB和tau蛋白有可能成为恢复神经功能研究和治疗脑缺血的新靶点。