论文部分内容阅读
果实色泽是果实重要的外观品质，而且是影响加工产品的重要因素。果实成熟过程中，颜色的形成是一个复杂的生理生化过程，受遗传、环境等因素的调节控制。目前，有关果实花色苷的研究热点之一为类黄酮代谢途径和苯丙烷类代谢途径。花色苷合成的前体物质——苯丙氨酸是莽草酸途径的一个产物，而氧化戊糖磷酸途径(OPPP)为莽草酸途径提供赤藓糖-4-磷酸等。作为OPPP的关键酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)在低温、紫外等环境条件下被显著诱导表达。但是，在果实花色苷形成的研究中，尚未见G6PDH所起作用的报道。本文以桃果实为试材，较为系统地研究了G6PDH在桃果实中的分布、分子量和活性调节，以及在调控花色苷形成中的作用。主要结果如下：
(1)通过不同离心力分离桃果肉细胞组分，对比细胞质和质体标志酶与G6PDH活性及其恢复率，研究了桃果实中G6PDH活性分布和分子量，结果表明，15,000g能够分离开细胞质和质体组分，并可以保持质体的完整。细胞质和质体中都有G6PDH活性。对不同的组分进行SDS-PAGE、native-PAGE和免疫印迹分析，检测到桃果实中G6PDH亚基为72kDa和61kDa，而在细胞质中只有一条72kDa的亚基；完整的G6PDH大小为252kDa利138kDa。推测桃果实G6PDH由四个亚基或者两个亚基组成。
(2)通过对桃果实的果皮和果肉维管束，进行了G6PDH的胶体金免疫电子显微镜亚细胞定位，结果显示，G6PDH主要分布于细胞质、叶绿体、有色体利维管组织加厚的次生壁中，而不存在于淀粉粒、液泡和初生细胞壁中。在转色期的桃果实中，叶绿体转变为有色体，而且其中G6PDH密度显著增加；维管组织的韧皮薄壁细胞中出现很多有色体，大量G6PDH胶体金颗粒出现在其中。
(3)自然生长的桃果实到转色期，细胞质和质体中G6PDH活性都增加，而且质体G6PDH数量增加显著，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性也伴随G6PDH活性增加而增加，之后花色苷等酚类物质迅速积累。套袋处理40d后摘袋的果实，G6PDH数量和活性明显增加，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性也伴随增加，果皮中花色苷等酚类物质也迅速积累。
(4)利用来自于野生薯芋中的、能够抑制动物血红细胞G6PDH的抑制剂——DHEA，处理套袋40d的果实，结果显示，DHEA能够抑制桃果皮中G6PDH活性，并且抑制果皮中花色苷含量的增加，表明G6PDH在花色苷等酚类物质合成中具有重要作用。
(5)在OPPP途径中，G6PDH的底物葡萄糖-6-磷酸和产物6-磷酸葡萄糖酸，能够明显提高PAL活性，而且增加总酚和总类黄酮含量。通过免疫定位显示，PAL主要分布于桃果肉细胞质、叶绿体、有色体以及维管组织细胞的加厚次生壁中，而不存在于淀粉粒、液泡利初生细胞壁中，结果表明PAL和G6PDH具有相同的亚细胞分区。
(6)G6PDH片段的克隆：通过RT-PCR方法和数据库资料，设计简并引物，扩增得到620bp的桃细胞质G6PDH片段，与马铃薯(No.X74421)、烟草(No.AJ001770)和拟南芥(No.AJ010970)细胞质G6PDH同源性达到89.72％，可以用作桃果实细胞质G6PDH的探针。
(7)G6PDH和PAL对蔗糖的协同响应：以双层果实袋对桃果实套袋处理40d，在自然生长桃转色之前采摘，以这些桃果实的果皮为试验材料，建立蔗糖温育试验系统。结果表明，200mM蔗糖能诱导桃果皮细胞质G6PDHmRNA以及蛋白数量和活性都增加，PAL活性和数量也相应增加，花色苷等酚类物质含量也伴随增加。