论文部分内容阅读
体外培养(In vitro culture,IVC)是胚胎体外生产的关键技术环节,对动物良种繁育、生殖与发育机理研究具有重要意义。当前,猪的胚胎在IVC后发育效率和质量均不理想,主要与猪IVC培养基不理想有关。研究表明,卵泡抑素(Follistatin,FST)能够加速牛和恒河猴早期胚胎首次卵裂,并提高囊胚发育效率及质量。本实验室前期发现,在完全培养基中添加FST虽然对猪胚胎早期体外发育有影响,但与牛、猴上的报道不尽一致。因此,本研究拟通过在化学限定性的IVC培养基(PZM-4)中补充FST,旨在探讨FST对猪胚胎体外发育的真实影响,为进一步优化猪早期胚胎IVC体系提供依据。具体试验如下:试验一不同亚型FST对猪孤雌激活胚胎(Parthenogenetic Activation Embryos,PAEs)早期发育的影响。将10 ng/m L不同亚型FST(FST-315、FST-300、FST-288)分别独立添加至PZM4中作为处理组,以不添加FST的PZM-4为对照组;激活后立即将PAEs随机等量分配到各组、同等条件下进行IVC。结果表明,各亚型FST均可显著提高胚胎早期卵裂率(IVC第24h卵裂率;P<0.05),各组IVC第48h总卵裂率无明显差异。FST-300组囊胚率显著提高(P<0.05),而FST-288主要促进囊胚总细胞数增加(P<0.05)。试验二不同亚型FST(FST-315、FST-300、FST-288)对猪核移植胚胎(Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos,NTEs)早期发育的影响。分组与试验一相同;将重构胚随机等量分配到各组、同等条件下进行IVC。结果显示,FST-315和FST-300有提高NTEs早卵裂率和总卵裂率的趋势,但与对照组相比差异不显著(P>0.05);在囊胚率和囊胚质量上,各亚型FST对NTEs囊胚率、囊胚总细胞数和滋养层细胞数的提高也不显著(P>0.05),但相对而言,在处理组中FST-300促进趋势较好。试验三不同浓度FST-300对猪NTEs体外发育的影响。以未添加FST-300的PZM-4为对照组,以分别添加10ng/m L、20 ng/m L、50ng/m L FST-300的PZM-4为处理组,随机将NTEs等量分配到各实验组,再于同等条件下进行IVC。结果是,20ng/m L处理组显著提高了NTEs总卵裂率(P<0.05);各组间NTEs囊胚率、囊胚总细胞数和TE细胞数差异不明显(P>0.05)。试验四为进一步筛选不同亚型FST最适添加浓度,以不加FST蛋白为对照组,分别在PZM-4中设定三种亚型FST蛋白的浓度梯度:FST-315(1、5、10 ng/m L),FST-300(10、20、50 ng/m L),FST-288(10、20、50 ng/m L),探讨能促进猪PAEs体外发育的FST最优亚型及浓度。结果显示,分别添加三种亚型FST的对应所有浓度梯度均可显著提高PAEs早期卵裂率(P<0.05),其中以20ng/m L FST-300处理组作用最明显。此外,10ng/m L和20ng/m L的FST-300还可显著改善PAEs囊胚发育率(P<0.05);5ng/m L FST-315组、20ng/m L FST-300组、10ng/m L和50ng/m L FST-288组对猪PAEs体外发育的促进作用主要体现在囊胚总细胞数上(P<0.05)。试验五不同亚型FST、不同浓度组合对猪PAEs体外发育的影响。以未添加FST的PZM-4为对照组,试验组则是在PZM-4中联合添加不同亚型的FST,其中组合1是联合添加FST-300(20ng/m L)、FST-315(5ng/m L)和FST-288(10ng/m L);组合2是联合添加FST-300(20ng/m L)、FST-315(5ng/m L);组合3是联合添加FST-300(20ng/m L)、FST-288(10ng/m L);组合4是联合添加FST-315(5ng/m L)、FST-288(10ng/m L)。组合5为单一添加FST-300(20ng/m L)。结果表明,与空白对照组相比,上述单一添加和组合添加均可显著提高PAEs的早期卵裂率(P<0.05);在囊胚率上,组合1、2、3和5均有明显促进作用(P<0.05);从囊胚总细胞数来看,组合4和5可显著改善囊胚质量(P<0.05)。但对照组、组合1和5之间的GDF9、BAX、BCL-xl、p53、KLF4、SOX2、OCT4、CDX2等胚胎发育相关基因表达无明显差异(P>0.05)。总之,本研究不仅发现FST对猪PAEs和NTEs的体外发育具有不同作用,还筛选出了可用于促进猪PAEs、NTEs早期卵裂、提高胚胎发育效率,改善PAEs胚胎质量的FST处理方案,进一步丰富了猪化学限定培养基配方组分,为今后深入揭示FST对胚胎发育的调控机制奠定了良好基础。