双色百合花具有奇特的花被片,具有极高的观赏价值。在百合‘Tiny Padhye’双色花被片发育的过程中,花被片下部逐渐由绿色变为紫色,而上部由绿色变为白色。然而,百合双色花形成的分子机理尚未揭示。百合双色花形成的分子机理的揭示可以为百合花色的人工调控及百合花色分子改良提供理论依据。本研究在测定双色百合花被片发育过程中叶绿素、花青素苷含量变化的基础上,通过RNA-seq技术测定双色花百合‘Tiny Padhye’上下部不同发育时期的花被片的转录组,通过生物信息学手段鉴定与叶绿素代谢以及花青素苷合成通路相关的结构基因和转录因子,并对参与百合双色花形成的关键基因LhUFGT和Lh SGR进行了鉴定和功能研究,从而揭示百合双色花形成的分子机制。主要研究结果如下:1.双色花百合‘Tiny Padhye’花被片发育过程中花青素苷和叶绿素含量变化HPLC结果表明,在百合紫色花被片下部,仅有矢车菊素3-O-β-芸香糖苷这一种花青素苷成分。在花被片上部未检测到花青素苷的存在。在花被片下部,花青素苷从花被片发育第一时期(S1)到第三时期(S3)逐渐升高,在第四时期(S4)则开始下降。叶绿素主要积累在花被片早期(S1和S2时期)的上下部,而在发育后期(S3和S4时期)的花被片中含量逐渐降低。2.百合双色花发育形成过程的转录组分析为了系统地研究不同发育时期百合双色花花被片的时空转录组变化情况,我们对双色花百合‘Tiny Padhye’的S2时期花被片的上下部以及对S1、S3和S4三个时期下部分别进行了转录组测序。共获得713,120,548条高质量序列,从头组装共获得295,787条unigenes。KEGG分析表明,61个unigenes属于了花青素苷合成基因;106个unigenes属于叶绿素代谢通路结构基因。进一步的差异基因表达分析表明,花青素苷合成基因在花被片下部特异协同表达导致花青素苷特异地积累于花被片下部,而在花被片上部不表达。百合花被片中叶绿素含量逐渐下降的原因为随着花被片的发育,叶绿素合成相关结构基因在花被片上下部的表达量逐渐下降,而叶绿素降解相关结构基因的表达量迅速上升。此外,通过WGCNA分析,参与调控百合花被片中花青素苷合成通路以及叶绿素代谢通路的候选转录因子也得以鉴定。3.百合双色花花被片发育过程中qRT-PCR内参基因的筛选qRT-PCR是一项广泛应用于基因表达水平研究的技术,该技术的准确性依赖于稳定表达的内参基因。本研究中,10个植物中常用作内参基因的持家基因被选为候选内参基因。分别使用geNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder和比较ΔCt法评价了这些候选内参基因在百合‘Tiny Padhye’不同发育时期花被片中以及不同试验条件下的稳定性。最终结果表明:在花被片不同发育时期中,TIP41和ACT为最适内参组合;在花被片遮光处理中,TIP41和F-box为最佳内参组合;在不同组织中,ACT、ACT11和EF1-α为最佳内参组合;在所有样品中,ACT、TIP41、ACT11为最佳内参组合。使用稳定性不同的内参分别计算了两个花青素苷合成相关基因LhF3′H和LhUFGT的表达水平,该结果进一步验证了筛选到的最适内参基因的可靠性。4.花青素糖基化基因Lh UFGT的克隆及功能研究克隆得到花青素糖基化关键基因LhUFGT基因,其开放阅读框(ORF)为1371 bp,编码456个氨基酸。系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸序列与已报道的3GTs蛋白聚在一起。基因时空表达分析表明,该基因在S1时期花被片下部不表达,而在S2和S3下部表达量最高,之后随着花被片的发育表达量逐渐下降;该基因在各个发育时期的花被片上部表达量均很低。该基因的表达趋势和花被片中花青素苷含量的变化趋势较相似。通过同源重组的方法成功构建含该基因ORF区的过表达载体pCAMBIA3301-Lh UFGT。该基因可以恢复3GT基因功能缺失的拟南芥突变体(ugt78d2)的表型。以上结果均表明LhUFGT蛋白具有3GTs家族成员的酶催功能。5.叶绿素降解基因Lh SGR的克隆及功能研究克隆得到叶绿素降解关键基因LhSGR基因,其开放阅读框(ORF)为753 bp,编码250个氨基酸。系统进化分析表明,该基因编码的蛋白与已报道的单子叶植物SGRs蛋白聚在一起。基因时空表达分析表明,该基因的表达趋势和花被片中叶绿素含量的变化成负相关,在花被片早期(S1和S2)表达量较低而在发育后期(S3和S4)含量较高。在烟草叶片中瞬时过表达该基因可以导致烟草叶片黄化。证明该基因参与百合花被片中叶绿素降解过程。