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目的:通过纳秒脉冲电场(nanosecond pulsed electric filed,nsPEF)消融细粒棘球蚴(echinococcus granulosus,E.g)的体外和体内实验,开展新型非致热微创消融技术-纳秒脉冲针对E.g的治疗学评价。筛选纳秒脉冲消融技术有效治疗参数,评估其应用于肝囊型包虫病(cystic echinococcosis,CE)临床治疗的安全性和有效性。通过门静脉注射E.g原头蚴,模拟自然感染途径,建成小鼠肝E.g模型,经调控门静脉注射原头蚴数量,优化模拟临床CE致病模型,重现小鼠门静脉到肝脏的感染路径和病程特征。采用纳秒脉冲消融仪对该模型病灶进行治疗与评价,在体外实验中筛选在固定脉宽、频率下,有效消融E.g的电场强度和脉冲个数,并在小鼠模型上验证其剂量效应,获得适宜治疗E.g的电极布局。方法:(1)采集临床B超和CT诊断为单囊型肝囊型包虫病CE,通过手术获取CE患者的原头蚴,经过1%浓度胃蛋白酶消化后判断原头蚴活性,配制浓度分别为2000个/100ul、200个/100ul、100个/100ul原头蚴混悬液,经C57BL/6小鼠门静脉主干注射后观察小鼠的死亡率,计算小鼠E.g的成囊率和分布,B超随访观察E.g囊肿的生长速率;(2)B超筛查C57BL/6小鼠肝E.g囊肿,观察固定脉宽350nm,频率1Hz/s,50脉冲数下,不同场强(21、14、7、0kV/cm)作用后1周、4周、8周肝E.g囊肿的大小、形态改变、囊壁结构改变判断纳秒脉冲对小鼠肝E.g囊肿的消融抑制效应。(3)观察固定脉宽350nm,频率1Hz/s下,不同场强(29、21、14、7、0kV/cm)和脉冲数(50、100)作用后第1、3、7天原头蚴的形态、活动度、完整性,判断纳秒脉冲对其的杀伤效应,HE染色观察原头蚴结构的变化,扫描电镜观察原头蚴超微结构改变;采集临床B超和CT诊断为多子囊型CE患者,选取直径5-10mm、光亮透明,弹性好的CE囊肿,观察固定脉宽350nm,频率1Hz/s下,不同场强(29、21、14、0kV/cm)和不同脉冲数(50、100)作用后第1、3、7天E.g囊肿内层塌陷情况判断纳秒脉冲对其的杀伤效应,HE染色观察E.g囊肿壁结构的变化。结果:(1)建立门静脉接种原头蚴的小鼠模型:2000个/100ul、200个/100ul、100个/100ul原头蚴混悬液经门静脉主干注射后小鼠感染率分别为90%(9/10)、100%(10/10)、63.6%(7/11),成囊率分别为0.7%~4.1%,0.6%~1.9%,0.6%~3.9%。病理切片显示注射后1周内,大部分原头蚴体积固缩,7天时原头蚴周围形成明显的炎症带,21天时可见存活的原头蚴发育出囊泡,42天时原头蚴细胞团消失,发育成一囊型病灶;(2)获得纳秒脉冲治疗小鼠肝脏原位e.g囊肿的有效剂量:小鼠e.g囊肿在纳秒脉冲治疗仪脉冲后21kv/cm脉冲组小鼠e.g直径的增长在脉冲后1、4、8周与对照组存在差异(p<0.05),呈缩小趋势,脉冲后1、4、8周的直径分别缩小1.4mm、1.2mm、1.7mm,肉眼观e.g囊肿壁增厚,透明度消失,而对照组小鼠e.g囊肿光滑透明,壁较薄、弹性较好,腔内囊液充盈清亮张力高,病理切片显示脉冲后8周e.g外纤维组织增厚,炎症反应带增宽明显;14kv/cm脉冲组小鼠e.g直径的增长在脉冲后8周与对照组存在差异(p<0.05),呈缩小趋势,脉冲后1、4、8周的直径增长分别为-0.4mm、0.4mm、-0.1mm;7kv/cm脉冲组小鼠e.g直径的增长与对照组无差异(p>0.05);对照组在脉冲后1、4、8周的直径增长分别为0.2mm、1.3mm、4.3mm。(3)纳秒脉冲对体外培养的原头蚴和e.g囊肿的的杀灭存在剂量效应:脉冲后第1、3天,29、21kv/cm脉冲组的原头蚴的杀伤率与对照组存在差别(p<0.05),50脉冲数下29、21kv/cm脉冲组第1天杀伤率分别为16.5%、12.9%,第3天的杀伤率分别为19%、12.6%;脉冲后第7天,29、21、14kv/cm脉冲组的原头蚴的杀伤率与对照组存在差别(p<0.05),50脉冲数下29、21、14kv/cm脉冲组第7天杀伤率分别为71.7%、64.3%、48.3%。100脉冲数下29、21kv/cm脉冲组第1天杀伤率分别为32.3%、15.6%,第3天的杀伤率分别为32.3%、16.7%,100脉冲数下29、21、14kv/cm脉冲组第7天杀伤率分别为79.2%、68.7%、49.2%,透射电镜见脉冲后原头蚴体表完整性被破坏;脉冲处理后e.g囊肿第1天发生明显的内层塌陷,与对照组相比存在差异(p<0.05),脉冲场强越大,塌陷率越高,50脉冲数、29kv/cm场强下,1、3天的塌陷率分别为75%、100%,21kv/cm场强下,1、3、5天的塌陷率分别为50%、75%、100%,14kv/cm场强下,1、3、5、7天的塌陷率分别为25%、62.5%、75%、75%,100脉冲数、29kv/cm场强下,1、3、5、7天的塌陷率分别为62.5%、87.5%、87.5%、100%,21kv/cm场强下,1、3、5、7天的塌陷率分别为50%、75%、75%、100%,14kv/cm场强下,1、3、5、7天的塌陷率分别为75%、87.5%、87.5%、100%。结论:(1)经小鼠门静脉注射e.g原头蚴可以成功建立小鼠e.g感染模型,注射200个原头蚴可以得到较高的感染率和较合适的囊泡个数,囊泡生长个数约1-4个,可以较好的模拟临床ce;(2)21kv/cm场强可以明显消融小鼠e.g,棘球蚴囊肿壁增厚,透明度消失,14kv/cm场强可以明显抑制小鼠e.g的生长;7kv/cm场强对小鼠e.g的生长无抑制作用。纳秒脉冲对小鼠e.g囊肿具有剂量效应,需要优化治疗参数,只有在足够高的电场强度下才能获得消融及抑制生长作用。(3)固定脉宽350nm,频率1hz/s下,29、21kv/cm电场强度下对原头蚴的杀伤效应较明显;e.g单囊肿对纳秒脉冲的消融效应较敏感,固定脉宽350nm,频率1hz/s下,29、21、14kv/cm电场强度下脉冲后第1天内层塌陷明显,场强越高、脉冲越数则e.g囊肿内层塌陷越早,提示纳秒脉冲在包虫病的消融临床应用上需要分型施治,选择恰当的适应症,根据WHO分型选择合适病例,设计个体化治疗方案。