论文部分内容阅读
本室前期通过对T-DNA插入突变体材料筛选和鉴定,克隆到调控水稻抽穗期的一个新的重要基因CDF1(Constitutive Delayed Flowering1)。该基因编码一个含C3HC4RING-finger结构域锌指蛋白的E3泛素连接酶。该基因的突变体长短日照条件下均表现为组成型的晚抽穗表型。本研究将重点研究CDF1参与的水稻抽穗期调控的分子网络,通过酵母双杂交技术和基因芯片技术鉴定与CDF1蛋白互作及受CDF1调控的基因,同时利用国内外水稻突变体资源,从遗传水平上阐释这些基因在水稻开花调控网络中的功能。本研究的主要结果如下：1.通过观察cdfl材料的田间表型和统计其抽穗期,采用基因组引物(R和F)及T-DNA引物LBT2鉴定cdfl材料的基因型,结果与前期结果一致：cdfl材料的突变表型与T-DNA纯合插入完全共分离；2.构建CDF1基因的ds RNAi载体,采用农杆菌介导方法成功获得阳性转基因植株；3.根据基因芯片结果共挑选74个差异表达基因,采用RT-PCR和Real-time PCR技术检测这些基因在cdfl材料和野生型植株中的表达量；结果表明：与野生型相比,在cdfl中有31个基因下降表达,26个基因上升表达,9个基因表达差异不明显,还有8个基因没检测结果,大部分检测结果与芯片结果相一致,其中很多开花调控基因都受到CDF1基因调控；4.构建22种融合不同长度CDF1蛋白片段的pGBKT7载体,通过酵母转化实验验证这些CDF1截短蛋白的转录活性,并证明CDF1蛋白的181～215氨基酸区间具有自激活活性；5.分别在水稻开花转换之前(播种后第35d)的10：00P.M.和9：30A.M.取倒二叶叶片的总RNA样,利用SMART同源重组交换技术分别在酵母菌株AH109和Y187中成功构建2个Y2H倒二叶叶片cDNA文库；6.共完成3次筛库工作,并用酵母共转化技术验证筛库结果的正确性, CDF1(99-619)筛选10:00P.M. cDNA文库得到21个互作蛋白；而CDF1(288-667)筛选10:00P.M. cDNA文库获得22个候选互作蛋白,筛选9:30A.M. cDNA文库获得21个候选互作蛋白；3次筛库共得到54个不同的互作蛋白；7.利用酵母点对点实验探索CDF1蛋白与其它开花基因的互作关系,结果发现CDF1蛋白与OsFMl蛋白互作,CDF1也与自身互作形成二聚体；8.用TAIL-PCR和APCR技术分离22份抽穗期突变体的侧翼序列,共得到17个家系的侧翼序列,其中15条插入位点是正确的。但共分离检测发现这些家系的突变表型不与基因型共分离,说明分离到的侧翼序列不是引起突变表型的侧翼序列。