随着社会的发展、人民生活水平的提高和健康意识的增强,加上由于营养比例和结构失衡导致的癌症发生率逐年上升,人们对饮食的需求已从量的满足转向对质的重视,希望通过合理的饮食结构安排,科学摄入营养成分,从而增强身体素质,预防和减少癌症的发生。膳食植物中的天然活性物质由于其具有良好的清除自由基的抗氧化作用产生的抗肿瘤作用效应,因而,被誉为人类“第八大营养素”。姜黄素类化合物(姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素)是从姜黄等天然植物中提取的一种多酚类化合物,常作为天然色素和调味品广泛应用于食品工业,研究表明,它具有广谱的抗肿瘤活性。然而,存在于食品中的姜黄素类化合物被人体吸收后生物利用度较低,难以发挥应有的抗氧化和抗肿瘤等活性功效,极大限制了它们的应用范围及应用价值。签于此,本文选取了在食品中作为食用香精的右旋龙脑(NB)作为吸收促进剂,考察其促进姜黄素类化合物抑制肿瘤细胞生长的影响,明确NB促进姜黄素类化合物抑制肿瘤细胞生长的分子机制。该研究有望揭示NB促进姜黄素类化合物抗肿瘤的分子作用机制,为姜黄素类化合物与NB等天然营养因子的高效、精准利用提供理论基础,也为癌症等慢性疾病的饮食预防干预提供理论依据。在研究中,主要选取Hep G2肝癌细胞作为研究对象,考察NB促进姜黄素类化合物抑制Hep G2肝癌细胞生长的影响并阐明其相关分子机制。一、筛选NB和姜黄素类化合物联合处理的最佳配比及处理时间首先,采用MTT方法考察NB和姜黄素类化合物在不同浓度下单独作用不同时间对Hep G2细胞存活率的影响。结果表明,随着姜黄素(Cur)的浓度和时间的增加,Hep G2细胞的存活率呈逐渐下降的趋势,说明,Cur抑制Hep G2细胞生长呈浓度和时间依赖性;而去甲氧基姜黄素(DCur)和双去甲氧基姜黄素(BDCur)只表现出浓度依赖性。姜黄素类化合物的抗肿瘤效果依次为Cur>DCur>BDCur,表明,随着甲氧基数目的减少,姜黄素类化合物抗肿瘤效果降低。在不同浓度下,NB单独作用于Hep G2肝癌细胞均没有表现出明显的抑制作用。然后,选取NB和姜黄素类化合物在不同浓度下进行不同组合配比,考察其联合处理不同时间对Hep G2细胞存活率的影响。结果表明,NB能显著提高姜黄素类化合物的抗肿瘤活性,且当20μg/ml NB与20μM Cur、40μM DCur、40μM BDCur分别联合作用24 h时对细胞的抑制作用最大。故,选择在这一浓度下处理24 h进行后序的实验。二、考察姜黄素类化合物进入细胞的途径及其在细胞中的作用部位采用荧光分光光度法考察姜黄素类化合物在Hep G2肝癌细胞内的含量,并深入探讨姜黄素类化合物进入细胞的途径,阐明姜黄素类化合物在细胞内的吸收机制。进一步运用荧光显微镜考察姜黄素类化合物在细胞中的定位,从而明确其在细胞中的分布。结果表明,NB能显著提高姜黄素类化合物在Hep G2细胞内的含量,从而提高其抗肿瘤活性。进一步研究发现,NB与姜黄素类化合物联合作用Hep G2肝癌细胞后,姜黄素类化合物主要通过转铁蛋白受体运输姜黄素类化合物进入细胞并定位在胞浆内激活下游信号发挥作用。三、考察NB提高姜黄素类化合物抗肿瘤活性的增效机理采用Western blot和细胞膜通透性实验考察NB提高姜黄素类化合物抗肿瘤活性的增效机理。结果表明,NB能够提高Hep G2细胞的细胞膜通透性,使得更多的姜黄素类化合物进入细胞,而且,NB能够下调转运蛋白ABCB1、ABCC1和ABCG2的表达量,减少姜黄素类化合物从细胞内泵出,从而提高姜黄素类化合物在细胞内的含量。以上两个原因的共同作用贡献了NB增效机理。四、考察NB促进姜黄素类化合物抑制Hep G2肝癌细胞增殖的分子机制采用流式细胞术、Western blot方法、DHE荧光光谱法和蛋白组学方法系统研究NB促进姜黄素类化合物抑制Hep G2肝癌细胞增殖的分子机制。结果表明,相比姜黄素类化合物,NB与姜黄素类化合物联合处理Hep G2细胞后显著提高了G2/M期的细胞数目,表明,NB促进姜黄素类化合物诱导细胞发生G2/M期阻滞。进一步的机理研究表明,NB与姜黄素类化合物联合作用显著减低了细胞周期蛋白cyclin B1及其激酶cdc2的表达量及增加了磷酸化的p53、ATM和MDM2蛋白的表达量,说明,NB与姜黄素类化合物联合作用启动了p53信号传导通路。并且,Akt和ERK1/2磷酸化表达水平的下调和JNK与p38MAPK磷酸化表达水平的上调在启动p53通路中发挥了重要的作用。蛋白组学研究表明,PSMA5、NPM和hn RNPC1/C2蛋白在NB与姜黄素联合调控p53通路中也发挥了重要的作用。研究还发现,活性氧(ROS)是NB与姜黄素类化合物联合诱导细胞发生G2/M阻滞信号通路的源头。因此,NB促进姜黄素类化合物抑制Hep G2细胞增殖是通过介导ROS过量产生从而启动p53通路激活下游信号诱导Hep G2细胞发生G2/M期细胞周期阻滞。