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研究背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,癌细胞的侵袭与转移是导致患者治疗后复发的关键因素。近年来,趋化因子受体CCR7在恶性肿瘤的表达和作用受到关注。例如:乳腺癌、胃癌、食管癌、甲状腺乳头状癌等许多肿瘤表达CCR7,而且其表达强度与淋巴结转移有密切关系。CCR7的配体为次级淋巴组织趋化因子19/21(CCL19/CCL21),后者特异性的表达于次级淋巴组织,如淋巴结、派伊尔集合淋巴结(peyer s patches, PP)、脾以及淋巴管内皮细胞等。因此,CCR7及其配体CCL19/CCL21被公认为特异性诱导肿瘤细胞向淋巴结转移。然而至今,CCL21/CCR7调控肿瘤细胞向淋巴结迁移的分子机制尚不清楚。癌细胞发生上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤领域近些年的研究热点。其主要特征是癌细胞的上皮细胞表型减少、间质细胞表型增加,从而获得侵袭、迁移能力。因此,EMT在肿瘤细胞发生淋巴结或血液转移中发挥关键作用。CCL21/CCR7在调控肿瘤细胞向淋巴结迁移过程中是否伴有EMT发生?在本文研究之前,国内、外均未见报道。本文以乳腺癌作为研究目标,假设CCL21/CCR7轴启动EMT程序诱发癌细胞向淋巴结定向迁移。实验目的:探究CCL21/CCR7轴是否能够诱导乳腺癌细胞EMT,从而促进乳腺癌细胞的淋巴结转移。材料和方法:1.收集60例女性乳腺癌患者的原位癌组织石蜡块并制作切片,应用免疫组织化学方法检测CCR7和EMT相关标志物N-cadherin、Slug的表达情况。2.用CCL21分别刺激乳腺癌细胞株1428、MCF-7和MDA-MB-231各48 h,然后采用Real time PCR和Western blot技术检测细胞株对CCR7和EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Slug、Vimentin的表达情况;分别采用创伤愈合实验和Matrigel侵袭实验检测CCL21/CCR7轴对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。3.采用脂质体转染技术,将质粒CCR7-shRNA(17428,17432)及其相应的空白质粒NC-shRNA转染MCF-7、MDA-MB-231细胞,沉默乳腺癌细胞的CCR7基因;CCL21分别刺激各转染细胞,Western blot技术检测转染组细胞CCR7和EMT标志物的表达情况;分别采用创伤愈合实验和Matrigel侵袭实验检测CCL21/CCR7轴对转染细胞迁移和侵袭能力的影响。4.运用统计学分析软件包SPSS17.0对以上实验结果进行统计学分析。结果:1.免疫组化染色显示,乳腺癌患者的原位癌组织中CCR7、N-cadherin、Slug呈高表达,表达率分别为60%(36/60)、76.67%(46/60)、65%(40/60),而且表达强度与淋巴结转移与否和临床病理分期有密切关系。另外,CCR7表达与N-cadherin、Slug表达呈正相关。2.CCL21刺激细胞株后,细胞的E-cadherin蛋白和mRNA表达水平下降,而CCR7、N-cadherin、Slug、Vimentin蛋白和mRNA表达水平上升;同时,乳腺癌细胞的迁移和侵袭数目均增加。3.沉默乳腺癌细胞株的CCR7基因,再用CCL21刺激癌细胞,与对照组比较,细胞对E-cadherin、N-cadherin、Slug、Vimentin的表达没有发生变化,即CCL21诱导的EMT受到抑制;癌细胞向CCL21区的迁移和侵袭数目明显减少。结论:CCR7、N-cadherin和Slug在乳腺癌组织高表达,并与淋巴转移有密切关系;CCL21/CCR7轴能够诱发乳腺癌细胞EMT,并由此促进乳腺癌细胞侵袭与向配体区域的定向迁移。意义:本文在国内、外首次研究CCL21/CCR7对乳腺癌细胞EMT的诱导作用,探寻其促进癌细胞定向迁移的分子机制。研究成果将对于阐明CCL21/CCR7促进肿瘤淋巴转移的分子机制、寻找其关键分子以选择有效的靶向治疗手段等奠定基础。