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目的通过体内实验,包括高尿酸血症模型、痛风性关节炎模型及炎症、疼痛模型,考察消风颗粒剂在整体水平上治疗痛风性关节炎的疗效,并通过急性毒性试验、长期毒性试验进行安全性评价,为消风颗粒剂做临床前研究以提供临床用药参考。在体内实验的基础上,结合体外细胞实验,研究消风颗粒剂对痛风关节软骨病变的影响,从而为阐明消风颗粒剂治疗痛风性关节炎部分作用机制提供实验数据。方法安全性评价方面:急性毒性试验以小鼠一日内口服消风颗粒剂可ig的最大浓度两次(生药量175.7g·kg-1 ×2),体积为35 ml·kg-1,观察给药后小鼠的毒性反应及14d内产生的迟发性毒性反应。长期毒性试验以大鼠连续三个月分别口服消风颗粒剂三个浓度梯度(生药量200,10,50 g·kg-1),每日一次,体积为30ml·kg-1,观察动物出现的毒性反应,剂量毒性效应的关系,主要靶器官,毒性反应的性质和损害程度及可逆性等。药效学研究方面:通过尿酸钠(MSU)诱导方法建立大鼠及家兔急性痛风性关节炎模型,测定大鼠足容积及家兔膝关节肿胀度、关节液白细胞计数(WBC)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6),取家兔关节囊、滑膜组织做病理组织学检查,探讨消风颗粒剂的抗痛风性关节炎的疗效。通过次黄嘌吟一氧嗪酸钾联合造模方法建立小鼠急性高尿酸血症模型及大鼠持续性高尿酸血症模型,测定小鼠血尿酸(UA)水平及大鼠血UA、尿UA水平、血清黄嘌呤氧化酶(XO)、肝脏XO水平,探讨消风颗粒剂的降尿酸作用。通过二甲苯致小鼠耳肿胀、HAc致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、纸片致大鼠肉芽肿试验,探讨消风颗粒剂的抗炎作用。通过醋酸致小鼠扭体反应试验,探讨消风颗粒剂的镇痛作用。作用机制研究方面:通过使用尿酸盐(MSU)刺激软骨细胞,运用血清药理学的研究方法,观察消风颗粒剂含药血清对软骨细胞的生长状态及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、IL-lβ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症介质的影响。通过检测软骨细胞糖胺多糖(GAGs)及羟脯氨酸(Hyp)的释放及甲苯胺蓝染色后蛋白多糖的表达,评价软骨基质中蛋白多糖及胶原降解的程度,并进一步检测基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、蛋白聚糖酶(ADAMTS-4)、基质组织金属蛋白酶抑制剂-3(TIMP-3),探讨消风颗粒剂抑制软骨细胞基质降解的作用机制,为消风颗粒剂防治痛风关节炎所致的关节软骨破坏提供实验依据。结果安全性评价方面:急性毒性试验小鼠ig给药当天见摄食量及自发活动减少,在24h内恢复正常;给药后14d内小鼠健康状况良好,外观、行为、排泄物等方面皆无异常现象,也未见有小鼠死亡;消风颗粒剂一日内小鼠最大给药量为生药量351.4g g·kg-1,相当于成人临床用药量的175.7倍。长期毒性试验大鼠ig给予消风颗粒剂大、中、小(生药量200,100,50 g·kg-1)三个剂量组连续三个月,相当于成人临床用药量的100,50,25倍,可见一般状况良好,外观、行为、排泄物等方面均未见异常变化;各组大鼠体重、摄食量、凝血系统、血常规、血液生化指标、脏器系数、主要脏器组织学检查均未见药物引起的毒性反应。药效学研究方面:通过MSU诱导大鼠、家兔急性痛风性关节炎,与模型组比较,MSU致炎1h后,消风颗粒剂大剂量组能降低GA大鼠踝关节肿胀度并抑制其变化率(P<0.05);致炎3,5h,大、中、小剂量组均能降低踝关节肿胀度上升趋势并抑制其变化率(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,MSU致炎1h后,大、中剂量组能显着降低GA家兔膝关节肿胀度并抑制其变化率(P<0.01,P<0.05);致炎3,5h,大、中剂量组能降低膝关节肿胀度上升趋势并抑制其变化率(P<0.01,P<0.05),且大、中剂量组能降低关节液WBC、IL-1 β、IL-6水平(P<0.01,P<0.05),有剂量依赖关系,大剂量组还能减轻滑膜、关节囊病变程度(P<0.05)。通过次黄嘌呤一氧嗪酸钾联合诱导小鼠、大鼠高尿酸血症,HUA小鼠与空白对照组比较,血UA明显上升(P<0.01),大、中、小剂量组均能降低其血UA水平(P<0.01)。HUA大鼠与空白对照组比较,血UA、尿UA、血清XO.、肝脏XO水平明显升高(P<0.01),单次给药大、中剂量组能降低其血UA(P<0.01)。连续给药5d,大、中剂量组能降低HUA大鼠血UA、尿UA(P<0.01,P<0.05),且能降低血液XO(P<0.01)。此外,与模型组比较,大、中、小剂量组均能降低二甲苯致小鼠耳肿胀(P<0.01),减轻HAc致小鼠腹腔毛细血管通透性增加(P<0.01),抑制纸片致大鼠肉芽肿(P<0.01,P<0.05);大、中剂量组能使醋酸致小鼠扭体次数减少(P<0.05),且能使小鼠第一次扭体时间明显延长(P<0.01,P<0.05)。作用机制研究方面:通过MSU刺激软骨细胞,与空白对照组相比,MSU刺激组(2000μmol·L-1)24h时细胞存活率即明显下降(P<0.01);MSU刺激组(1000 μmol·L-1)48h细胞存活率明显下降(P<0.01):MSU刺激组(500,250 μmol·L-1)细胞存活率无明显差异(P>0.05)。通过消风颗粒剂含药血清(XF-CS)作用于软骨细胞,与空白血清组比较,XF-CS对软骨细胞生长无明显影响(P>0.05)。通过NMSU和XF-CS共同作用于软骨细胞,与MSU刺激组比较,MSU+XF-CS(5,10,20%)共同作用于软骨细胞48,72h后,细胞生长百分率明显上升(P<0.01,P<0.05)。炎症介质方面,与MSU刺激组比较,MSU +XF-CS(10,20%)IL-1β 及 TNF-α水平均明显下降(P<0.01,P<0.05),MSU + XF-CS(5%)TNF-α水平明显下降(P<0.01);MSU+XF-CS(5,10,20%)iNOS及NO含量均明显下降(P<0.01)。细胞基质方面,MSU+XF-CS(10,20%)释放出的GAGs含量降低(P<0.05),且 MSU+XF-CS(5,10,20%)均可见 Hyp 含量下降(P<0.01);MSU+XF-CS(10,20%)镜下可见软骨细胞甲苯胺蓝染色蛋白多糖表达上升(P<0.05);MSU+XF-CS(10,20%)MMP-3含量及ADAMTS-4蛋白表达下降(P<0.01,P<0.05),且MMP-3/TIMP-1及ADAMTS-4/TIMP-3 比值也明显降低(P<0.01,P<0.05),其中 MSU+XF-CS(5,10,20%)TIMP-3蛋白表达明显上升(P<0.01,P<0.05)。结论消风颗粒剂小鼠急性毒性试验及大鼠长期毒性试验,大剂量服用消风颗粒剂对动物无毒性反应,且较长疗程服用后亦无蓄积性的毒性作用。消风颗粒剂对高尿酸血症模型动物有降UA作用,并对痛风性关节炎模型动物有良好的抗炎作用,其作用机制可能与降低XO活性,抑制炎症部位IL-1β、IL-6合成有关。此外,消风颗粒剂可抑制急性炎症的渗出、慢性炎症肉芽组织的增生及化学性刺激所致的扭体反应,进一步说明消风颗粒剂有一定的抗炎及镇痛作用。以痛风性关节炎动物实验为基础,从细胞水平探讨消风颗粒剂减轻痛风关节软骨破坏的作用机制:软骨细胞MSU刺激后细胞存活率随MSU浓度的提高呈逐渐下降的趋势,当MSU浓度为1000μmol·L-1,软骨细胞于48h时细胞存活率开始下降,镜下可见部分细胞死亡,但多数细胞胞质仍完整,故以此为适宜浓度、时间点进行后续试验。消风颗粒剂对软骨细胞有一定的保护作用,且非是由于干预软骨细胞存活率所致,其作用机制可能通过降低IL-1β及TNF-α分泌,抑制iNOS活性及NO的合成,从而阻断炎症反应的路径而发挥抗炎作用;通过抑制MMP-3、ADAMTS-4及上调TIMP-3活性,减轻软骨基质中蛋白多糖、胶原降解的程度,从而降低GAGs、Hyp的流失,防止软骨结构的崩坏,使关节病变有所减轻,继而影响炎症的发生、发展,防止软骨基质降解与炎症反应之间的恶性循环,保护软骨细胞基质合成的功能,以达到关节软骨基质汰旧换新的动态平衡。