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猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染引起的猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是一种高度接触性肠道传染病,临床症状主要为发热、呕吐、严重腹泻和脱水等,属于世界动物卫生组织(OIE)规定的B类传染病。TGEV主要经口鼻到达小肠,于小肠上皮细胞内进行大量复制,扰乱肠腔内营养物质和电解质(尤其是钠离子)的吸收和转运,使肠道渗透压升高,导致腹泻。生理情况下,机体内大量Na~+主要通过Na~+/H~+交换体介导的电中性途径被膜转运蛋白NHE3(Na~+/H~+exchanger 3)吸收,进而形成渗透梯度,增加肠道对水的被动吸收。基础条件下,NHE3同其他膜转运蛋白一样,在质膜和循环内小体之间进行循环,这期间依赖于来自Rab5a特异性的早期内体(Early endosome,EE),以及通过Rab11a特异性的再循环内体(Recycling endosome,RE)经内质网和高尔基体的重加工,在受到EGFR/Rsk2或Ezrin等关键蛋白活性刺激时,从这些再循环内体易位到质膜。不能被重复利用的成分则进入Rab7a特异性的晚期内体(Late endosome,LE)与溶酶体融合进行蛋白的降解清除。病理状态下,NHE3的活性与腹泻的发展密切相关。有研究证明,NHE3基因敲除、NHE3基因缺失或NHE3抑制剂处理过的的小鼠,其肠道组织正常分化和组织结果均受到影响,且对Na~+、水的吸收明显减少并出现严重腹泻。因此,研究肠道NHE3活性的调控机制,对将来治疗腹泻或者肠道感染和炎症都具有重要的现实意义。肠道腹泻病毒TGEV的感染下,是否影响肠上皮细胞中NHE3的活性,从而引起肠上皮细胞的Na+/H+交换的生理活性,最终导致肠道电解质紊乱?鉴于此,本课题以小肠上皮细胞IPEC-J2为感染模型,在TGEV感染下,通过研究TGEV感染下,NHE3的钠氢交换活性变化、细胞内NHE3总蛋白和质膜表面蛋白表达量的变化、刺激NHE3易位的Ezrin和Rsk2等关键蛋白的表达量变化及磷酸化变化、胞内NHE3表达量变化以及IPEC-J2自噬和NHE3的泛素化等研究内容,为阐明TGEV感染影响NHE3的活性的机制提供理论依据,也为揭示TGEV的发病机理提供新思路。主要研究内容如下:(1)TGEV感染IPEC-J2后NHE3的Na~+/H~+交换活性变化、总蛋白表达情况:TGEV感染IPEC-J2后,利用pH荧光探针BCECF-AM分别检测TGEV感染不同时间下NHE3的H~+交换活性。结果发现,与对照组相比,TGEV感染后,IPEC-J2细胞内H~+浓度随感染时间逐渐增大,表明NHE3的H~+交换活性逐渐下降。利用火焰原子吸收法检测TGEV感染后不同时间点细胞内、外液中Na~+的浓度,结果显示TGEV感染胞内Na~+总体随时间逐渐减少,胞外Na~+随时间逐渐增加,进一步验证了TGEV感染能导致NHE3的Na~+/H~+交换活性降低。(2)TGEV感染下对NHE3易位至质膜的影响:TGEV感染IPEC-J2不同时间点后,分别利用RT-qPCR和Western-blot技术检测刺激NHE3易位的关键蛋白Rsk2和Ezrin的mRNA水平和蛋白及其磷酸化水平变化。结果表明,TGEV感染后期(48hpi和72hpi)Rsk2和Ezrin蛋白及其磷酸水平均降低,说明TGEV能抑制NHE3易位的关键蛋白Rsk2和Ezrin等,从而抑制NHE3从胞质到质膜的易位。通过生物素酰化标记膜蛋白、免疫荧光(Immunofluorescence,IFA)及激光共聚焦等技术,检测TGEV感染后不同时间点细胞膜上NHE3的蛋白表达量变化。结果显示,与对照组相比,TGEV感染组细胞质膜上NHE3的量显著性减少,表明TGEV感染可以降低NHE3的质膜表达。(3)TGEV感染下内体中NHE3表达变化:TGEV感染IPEC-J2后,通过内体提取试剂盒提取不同感染时间点的内体,利用Western-blot技术检测内体中NHE3的蛋白表达量。结果显示,内体中NHE3的蛋白量随TGEV感染时间逐渐增加,表明TGEV感染会刺激内体的活动,并增强NHE3胞内转运。采用免疫荧光及激光共聚焦等技术,检测TGEV感染后不同时间点胞质中再循环内体指示蛋白Rab11a和NHE3的蛋白表达量变化。结果表明,TGEV感染后,再循环内体中的Rab11a和NHE3在TGEV感染前期(0hpi和2hpi)显著性增加,在TGEV感染后期(48hpi和72hpi)有所下降,进一步验证了TGEV感染前期可以刺激NHE3的胞内转运。(4)TGEV感染下IPEC-J2细胞自噬和NHE3的泛素化降解情况:TGEV感染IPEC-J2不同时间点后,利用细胞自噬检测试剂盒评估TGEV感染对IPEC-J2细胞自噬的影响。结果表明,随着TGEV感染时间的增加,IPEC-J2细胞自噬逐渐呈显著性增加。其次,利用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)技术,检测TGEV感染后不同时间点NHE3泛素化降解的变化情况。结果显示,随着TGEV感染时间的增加,IPEC-J2细胞中NHE3的泛素化逐渐增加,尤其在TGEV感染后期(48hpi和72hpi)。结果表明,TGEV感染后期IPEC-J2自噬加剧,并且可以刺激NHE3的泛素化降解。