铁是生物体生命活动必需的微量元素,但海洋中的铁通常以螯合物或者氢氧化铁的形式存在,使得铁元素含量远远低于其在地壳中的比例。为了适应海洋中的低铁环境,海洋硅藻进化出多种适应策略,如合成和分泌铁载体来增强铁的吸收。而大多数铁载体采取的是非核糖体肽合酶（non-ribosomal peptide synthases,NRPSs）参与的生物合成途径,主要负责合成铁载体的核心骨架结构。典型的NRPSs由腺苷酰化（adenylation,A）结构域、疏基化（thiolation,T）结构域、缩合（condensation,C）结构域和硫酯酶（thioester,TE）结构域组成。三角褐指藻是羽状硅藻的代表性硅藻,在远洋海水表层以及深海中都有发现,但对于其应对低铁胁迫机制尚不明确。本课题组前期通过基因挖掘技术,在三角褐指藻基因组中发现了4个潜在的NRPSs基因簇。其中,NRPS1基因簇中的NRPS具有A-T-TE三个结构域,并在其上下游发现了Nit1和NAT等与次生代谢相关的基因。同时,在三角褐指藻20号染色体上发现了Nit2基因,与Nit1基因具有40%的序列一致性。对NRPS1和其他关键基因进行基因克隆并在大肠杆菌中异源表达,纯化后分别得到140、40、40和84 k Da的重组蛋白。同时,为使NRPS具有催化作用,需要sfp蛋白和辅酶A一起将无活性的apo型NRPS转化成有活性的holo型NRPS,于是对sfp也进行了基因克隆以及异源表达,得到32 k Da的重组蛋白。以20种氨基酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸和D-天冬氨酸α酰胺为底物对重组His₆-NRPS1腺苷结构域进行活性检测,结果显示其以L-Asn为最适底物。随后,以L-天冬酰胺为底物,探索His₆-NRPS1的酶促产物,用液质联用的方法检测发现,可能存在大肠杆菌自身合成的物质的干扰,后续将利用酵母异源表达NRPS1蛋白来探索酶促产物。以20种氨基酸为待测底物,利用PLP以及光谱扫描的方法对Nit1和Nit2的底物进行特异性检测,结果显示均以半胱氨酸为底物。采用柱前衍生化后,经荧光HPLC检测,发现NAT的底物为L-天冬酰胺并有相应的产物生成。随后,采用液质联用的方法检测其产物,也发现可能有大肠杆菌自身合成产物的影响,后续将采用在酵母中表达重组蛋白的方法来探索其酶促产物。通过对三角褐指藻NRPS1及其周围关键基因的研究,探索在次级代谢产物合成过程中各基因的功能,为挖掘硅藻中潜在的铁载体合成途径提供了基础。