【摘 要】
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目的探究黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）通路在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）致大鼠的肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）通透性变化中的调控作用及分子机制,为进一步探究急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARD
【基金项目】
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国家自然科学基金项目资助（No.81770081）；
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目的探究黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）通路在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）致大鼠的肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）通透性变化中的调控作用及分子机制,为进一步探究急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）的发病机制以及寻找新的潜在治疗靶点提供实验依据。方法1、通过CD34相关抗原、VIII因子相关抗原免疫荧光实验鉴定体外分离培养的细胞是否为大鼠PMVECs（rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVECs）;2、通过免疫荧光和免疫印迹分析鉴定RPMVECs上IQ结构域GTP酶激活蛋白（IQGAPs）三种不同亚型的分布及表达含量有何不同;3、分别配制不同浓度的LPS（0、0.1、1、10、100μg/ml）作用于RPMVECs不同的时间（0、1、3、6、12、24h）,然后用Western-blot法检测其IQGAP1的表达含量变化;4、配制10μg/ml浓度的LPS作用于RPMVECs 12h,用Western-blot法检测p-FAK以及FAK的蛋白表达含量变化;PF-573228刺激RPMVECs 30min后,再用LPS刺激RPMVECs 12h,用Western-blot法检测IQGAP1及FAK、p-FAK的蛋白表达含量变化;5、通过免疫组化比较LPS刺激组与FAK抑制剂PF228+LPS组处理RPMVECs后,RPMVECs上骨架蛋白F-actin的不同变化;6、建立体外Transwell细胞单层模型,配置不同工作浓度的LPS溶液（0、0.1、1、10、100μg/ml）,诱导RPMVECs不同时间后（0、1、3、6、12、24h）后,测量跨内皮细胞电阻（Trans-epithelium electrical resistant,TER）值的变化;再分别设立对照组、LPS组以及PF228+LPS组,测量RPMVECs的电阻值变化。结果1、体外成功分离、培养RPMVECs,CD34和Ⅷ因子免疫组化鉴定后证实所培养细胞为RPMVECs;2、免疫荧光结果提示:IQGAP1主要位于细胞和质膜连接处;IQGAP2主要位于质膜和囊泡;而IQGAP3主要定位于细胞核仁。荧光半定量结果提示IQGAP1的表达含量最高,其次是IQGAP3,IQGAP2的表达含量则最低;3、LPS处理RPMVECs后结果提示:IQGAP1的表达量分别随着LPS的浓度和时间梯度的上升而上升,即10μg/ml的LPS刺激RPMVECs 12h后表达含量最高;4、LPS诱导RPMVECs 12h后,IQGAP1和p-FAK的蛋白表达含量均明显上升,FAK表达含量无明显变化;10μMPF228刺激RPMVECs 30min后,再用LPS刺激RPMVECs 12h,IQGAP1和p-FAK表达含量均明显下降,FAK表达含量无明显变化;5、对照组可见F-actin呈细丝状沿着RPMVECs长轴均匀排列,并且大部分位于胞膜内侧胞浆内;LPS处理组可见F-actin排列杂乱无章,部分F-actin聚集为粗大应力纤维;而在PF228+LPS处理组,F-actin较LPS组排列杂乱程度有所改善,粗大应力纤维明显较少,但IQGAP1的表达较LPS组亦有所较少;6、10μg/ml LPS作用RPMVECs第12h,TER值最小,RPMVECs单层通透性最大。在不同处理组中,对照组RPMVECs的TER值随着时间基本稳定不变;LPS诱导RPMVECs组TER随着时间逐渐下降,至12h到底最低值,此后维持至24h;PF228+LPS处理RPMVECs组TER随着时间亦逐渐下降,至12h到达最低值,且PF228+LPS组TER始终高于LPS组且低于对照组。结论LPS可以引起RPMVECs高通透性以及高表达IQGAP1和p-FAK,从而导致RPMVECs屏障功能受损,抑制FAK信号通路可以改善LPS对RPMVECs屏障的致损效应。
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