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急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是一种短时间内出现肾功能快速减退而导致的临床综合征,它由多种病因引起,其生理表现为肾小球滤过率(GFR)的快速下降,以及氮质废物比如肌酐、尿素氮的增高,水、电解质和酸碱平衡发生紊乱,重者可出现多个系统的并发症。AKI的病因多种多样,但是根据AKI病因的发生部位可将其分为分为肾前性、肾性和肾后性三大类。肾性AKI指出现肾实质损伤,以肾缺血和肾毒性药物或毒素导致的急性肾小管坏死(acute tubular necrosis,ATN)最为常见。顺铂(cis-platinum)是一种无机铂化学治疗剂,广泛用于各种实体恶性肿瘤的治疗。使用顺铂会产生各种重大的副作用,例如骨髓抑制,周围神经病变,耳毒性,过敏反应和肾毒性等。在顺铂的单次治疗剂量后(50-100mg/m2),大约33%的患者会发生肾毒性。顺铂诱导的AKI的病理生理学主要涉及4个主要机制:近端肾小管损伤,氧化应激,炎症和肾脏血管损伤。近端肾小管损伤涉及几种不同的机制,包括凋亡、自噬、对肾小管上皮细胞的直接毒性、DNA损伤和线粒体功能障碍等。自噬(Autophagy)是细胞质中受损细胞器、蛋白质聚集体和其他大分子大量降解的过程,基本作用是回收受损或变性的细胞成分,或在营养缺乏期间,维持体内平衡和细胞活力。有研究表明自噬可以保护顺铂诱导的近端肾小管的细胞损伤。也有研究指出自噬通过减轻近端小管特异性自噬缺陷小鼠的DNA损伤和线粒体损伤而对AKI具有保护作用。T细胞免疫球蛋白和粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,Tim-3)是最初被发现于Th1细胞上的负性免疫相关调节分子,在多种炎症相关性疾病例如肿瘤、慢性感染性疾病中发挥重要作用。最近的研究发现Tim-3在各种免疫细胞例如NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞中都存在表达而且发挥着不同的调控作用。到目前为止,Tim-3在非肿瘤性的肾脏疾病中比如肾炎、肾损伤中的研究仍然不多。有研究发现缺血再灌注(IRI)诱导的AKI中,Tim-3可通过激活TLR4/NF-κB信号通路从而活化NLRC4炎症小体导致IRI加重。而另有研究表明Tim-3通过促进巨噬细胞通过NF-κB/TNF-α途径的活化,加重了糖尿病肾病的足细胞损伤。顺铂诱导的AKI是临床上常见的药物性AKI,在各种肿瘤治疗过程的副作用中占据了相当大的比例,Tim-3是否参与了药物性AKI的发生发展过程,还未有报道。本课题以顺铂诱导的AKI小鼠为疾病模型,探讨Tim-3在药物性AKI中的作用以及对自噬相关功能的影响,通过研究Tim-3在AKI中的表达以及自噬相关分子的变化,阐明Tim-3可能参与AKI的发生发展,为药物性AKI的研究与治疗提供新的方向与策略。主要研究结果如下:1、顺铂诱导AKI导致肾近端小管损伤,Tim-3表达增加将顺铂按照1mg/ml的浓度将顺铂溶于生理盐水中,6-8周龄的C57BL雄性小鼠按照20mg/kg的剂量进行腹腔注射。72小时后处死小鼠,留取血液测量肌酐、肾组织进行蛋白质印迹与组织学染色。结果显示小鼠肌酐升高,体重下降,且具有统计学差异,说明AKI小鼠模型建模成功。HE染色和PAS染色结果显示AKI小鼠的肾脏近端小管损伤,小管上皮细胞坏死脱落,刷状缘缺失,管型形成、堵塞等。Tim-3的蛋白质印迹结果与免疫组化结果显示AKI小鼠中Tim-3表达增高且结果具有统计学差异。2、阻断Tim-3加重肾脏损伤使用顺铂构建AKI组与RMT组小鼠模型。在小鼠腹腔注射顺铂前24小时以及48小时后对RMT组腹腔注射Tim-3抗体RMT3-23以达到阻断Tim-3的效果。72小时后处死小鼠,留取血液、肾组织进行实验。首先检测Tim-3的阻断结果,RMT组的蛋白质印迹与免疫组化结果显示Tim-3表达下降且具有统计学差异,说明Tim-3阻断成功。两组小鼠模型的肌酐均升高、体重均下降,说明AKI建模成功,但是没有统计学差异。对小鼠肾组织切片染色,结果显示两组小鼠的肾近端小管均出现损伤、坏死,但是对两组的肾组织损伤情况进行评分,发现MT组关于肾组织损伤的评分更高且具有统计学差异。而肾损伤标志分子NGAL的结果显示RMT组的表达增高且与AKI组相比具有统计学差异。这些结果说明阻断Tim-3有效果,而且阻断Tim-3之后加重了顺铂诱导的AKI。3、阻断Tim-3后自噬受抑以往的研究表明,自噬对肾脏的近端小管具有保护作用。为了检测自噬可能参与的作用,我们测量了自噬分子标志物P62、LC3II的表达情况。结果显示与AKI组相比,RMT组P62表达增高,LC3II表达下降。由于LC3II是自噬小体形成过程中的重要分子,而P62在自噬过程中具有极为重要的调控作用,这两个分子的变化说明阻断Tim-3之后,自噬小体形成受抑,自噬功能收到抑制,从而加剧了肾脏损伤。综上所述,我们发现Tim-3在AKI中表达升高;阻断Tim-3后肾脏皮质损伤加重;阻断Tim-3之后自噬受抑,表明Tim-3可能参与自噬功能的调控。本课题发现Tim-3在药物性AKI中表达上升,阻断Tim-3后,自噬功能受抑,肾脏皮质损伤加重。这为药物性AKI的研究提供了新方向,并为寻找AKI的临床治疗靶点提供了理论依据。