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一.研究背景脓毒症是烧伤感染的永恒议题之一,尽管烧伤的诊疗水平一日提高,脓毒症患者的死亡率仍远未达到令人满意的水平。Sepsis3.0揭示脓毒症的本质,是机体严重感染反应失控引起的器官功能障碍综合征,表明了炎症反应的程度若失去有效的反馈和调控,将引起机体损伤的严重后果。大量的统计和研究表明,引起宿主脓毒症失控炎症级联反应的主要原因,是革兰氏阴性细菌的细胞壁内毒素。TLR4主要识别革兰氏阴性菌脂多糖(LPS),TLR2的配体则更为广泛,经刺激后引起丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等细胞内的信号级联,最终NF-KB等转录因子将上调各类促炎和抗炎细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等炎性因子的表达和活化。lnc RNA是转录本长度超过200个核苷酸单位的非编码RNA,既可本身作为调控因子,又通过可与蛋白、RNA及DNA结合发挥功能,主要在转录水平及转录后水平影响蛋白的表达。lnc RNA对表观遗传和基因转录的调控,以及其与疾病发生发展,尤其时老年痴呆、癌症等领域的研究,一直是长期以来的研究热点。最新的免疫基因表达的调控研究表明,长链非编码RNA(lnc RNA)在其中发挥着的重要作用,承担着控制炎症反应平衡的微妙作用。课题组前期研究中,利用表达谱高通量芯片技术,在脓毒症急性肺损伤患者血清中筛选出在脓毒症急性肺损伤及正常对照健康者之间存在明显差异性的lnc RNA-AC013472.3,在细胞水平研究炎性反应时,其对TNF-α、IL-6及ICAM-1m RNA变化及对MAPK(JNK、ERK1/2)和NF-κB信号通路的影响。研究lnc RNA在炎症反应中的功能与机制,将为探索脓毒症本质,诊疗脓毒症中失控炎症级联反应提供了新思路和新手段。二.研究目的本研究以NR8383大鼠肺泡巨噬细胞为实验对象,探究细胞水平上lnc RNA-AC013472.3在NR8383大鼠肺泡巨噬细胞炎性反应中的作用:(1)lnc RNA-AC013472.3对NR8383巨噬细胞细胞因子TNF-α、IL-6及ICAM-1释放的作用(2)lnc RNA-AC013472.3对NR8383巨噬细胞MAPK(JNK、ERK1/2)和NF-κB信号通路的影响。三.研究内容常规培养NR8383大鼠肺泡巨噬细胞,通过设计siRNA进行干扰,构建lnc RNA-AC013472.3沉默模型;通过设计质粒转染细胞,构建lnc RNA-AC013472.3过表达模型。刺激组采用10ug/ml LPS刺激24h。第一部分lnc RNA-AC013472.3对NR8383巨噬细胞细胞因子TNF-α、IL-6及ICAM-1释放的作用NR8383大鼠肺泡巨噬细胞常规培养后分为8份。对照组和实验组均包括:(1)沉默模型未刺激组与刺激组;(2)过表达模型未刺激组与刺激组。使用荧光定量PCR(Quantitative PCR,q PCR)方法检测细胞上清液中TNF-α、IL-6及ICAM-1m RNA的表达。第二部分lnc RNA-AC013472.3对NR8383巨噬细胞MAPK(p38、JNK、ERK1/2)和NF-κB信号通路的影响NR8383大鼠肺泡巨噬细胞常规培养后分为对照组和实验组,对照组和实验组均包括:(1)沉默模型未刺激组与刺激组;(2)过表达模型未刺激组与刺激组。使用Western Blot(WB)法检测ERK?、IKBα、p-IKBα、IRAK-1、JNK、MAPK、NF-κB和TRAF-6的表达。四.研究结果第一部分(1)对照组大鼠肺泡巨噬细胞NR8383在受到LPS的刺激(10ug/ml)24小时后,TNF-α、IL-6和ICAM-1在m RNA水平上的表达量均会增加至约2倍。(2)在LPS的刺激下,lnc RNA-AC013472.3沉默组细胞中TNF-α、IL-6和ICAM-1在m RNA水平上的表达量也会增加,且增至约4倍,与对照组相比显著增加(P<0.05)。(3)在LPS的刺激下,lnc RNA-AC013472.3过表达组细胞中TNF-α、IL-6和ICAM-1在m RNA水平上的表达量增加并不明显(P>0.05)。综合以上结果反映出,在LPS刺激下,细胞中的lnc RNA-AC013472.3会抑制TNF-α、IL-6和ICAM-1在m RNA水平上的表达。第二部分(1)在LPS刺激下,细胞中的lnc RNA-AC013472.3可以抑制ERK?、IRAK-1、JNK、P38、NF-KB、TRAF-6在蛋白水平上的表达。(2)lnc RNA-AC013472.3在大鼠肺泡巨噬细胞中起到抑制IKBα的磷酸化的调控作用,且同时可能是细胞维持IKBα与P-IKBα动态平稳所必需。五.研究结论1.lnc RNA-AC013472.3在NR8383大鼠肺泡巨噬细胞中,可抑制细胞因子TNF-α、IL-6和ICAM-1的释放。2.lnc RNA-AC013472.3在NR8383大鼠肺泡巨噬细胞中,可抑制MAPK(P38、JNK、ERK1/2)和NF-κB信号通路的激活。