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镉作为有毒的重金属污染物,广泛分布于环境中,通过直接和间接方式进入人类和动物体内,主要蓄积在肝、肾和骨骼,其生物半衰期在体内可长达10-30年,目前镉对骨骼代谢的毒性机制尚未明确。近年来P2X7受体对骨代谢的调控受到广泛关注。通过药理学方式激活或抑制P2X7受体研究成骨细胞和破骨细胞功能的变化,发现P2X7受体敲除的小鼠没有表现出明显的骨代谢异常,但去卵巢小鼠骨质疏松模型P2X7受体敲除加剧骨质疏松症状。然而,P2X7受体对成骨细胞和破骨细胞功能的调控机制尚未阐明。本研究以小鼠骨髓间充质干细胞和骨髓单核巨噬细胞为体外研究模型并结合小鼠体内实验,探索镉暴露不同时间对成骨细胞和破骨细胞分化的影响,通过Western blot、qRT-PCR、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术等实验技术,检测细胞分化和凋亡相关指标,从分子水平揭示镉致小鼠骨骼损伤的机制,为预防和治疗镉中毒提供新的理论依据和治疗靶点。主要研究内容如下:1.镉对成骨细胞和破骨细胞分化的影响以成骨细胞和破骨细胞前体细胞为研究模型,用Western blot、ALP染色、茜素红染色等方法检测了成骨细胞和破骨细胞分化相关的指标。长期（72h）镉暴露后,镉抑制了骨髓间充质干细胞的成骨和矿化,成骨关键蛋白COL1A1、OPN和OCN以及成骨调控因子RUNX2的蛋白和基因表达水平显著下调（p<0.01）。长期镉暴露也明显抑制了破骨细胞的形成和骨吸收活性,破骨细胞分化及骨吸收关键蛋白TRAP、CAII、CK和MMP-9的表达水平显著低于对照组（p<0.01）,调控破骨细胞分化关键因子NFATc1的蛋白表达也显著下降（p<0.01）。短期（12h）镉暴露后,成骨细胞和破骨细胞分化的后期细胞存活率明显增加（p<0.01）,细胞凋亡率降低（p<0.01）。Western blot检测成骨细胞和破骨细胞的自噬过程,短期镉暴露显著抑制了成骨细胞LC3II的累积,增加了P62的表达（p<0.01）;而短期镉暴露增加了破骨细胞中LC3II的累积,加速了 P62的降解过程（p<0.01）。在破骨细胞分化后期添加镉处理12 h,结果显示破骨细胞的骨吸收活性增加（p<0.01）,伪足小体结构较对照组更加明显,破骨细胞黏附关键蛋白Integrinαvβ3的表达显著上调（p<001）,伪足小体关键蛋白Paxillin、Vinculin、PYK2和SRC的磷酸化水平显著增加（p<001）。结果表明,长期镉暴露抑制了成骨细胞和破骨细胞的分化,而短期镉暴露更有利于成骨细胞和破骨细胞存活。2.P2X7受体在镉抑制成骨细胞和破骨细胞分化中的作用为了探讨P2X7受体在镉抑制成骨细胞和破骨细胞分化中的作用,本试验用腺病毒和慢病毒转染细胞建立P2X7敲减和过表达的细胞模型,用Western blot、ALP染色、茜素红染色和TRAP染色等方法检测了成骨细胞和破骨细胞分化相关的指标。结果显示,长期镉暴露后P2X7受体蛋白表达水平呈剂量依赖性降低（p<0.01）,其下游PI3K/AKT信号也显著抑制（p<0.01）。P2X7受体敲减明显抑制了成骨细胞ALP活性和矿化结节的形成,成骨关键蛋白的表达显著降低（p<0.01）,破骨细胞的数量和骨吸收活性也显著降低（p<0.01）,骨吸收关键蛋白的表达显著下调（p<0.01）。过表达P2X7受体后长期镉暴露对成骨细胞和破骨细胞分化的抑制作用显著缓解（p<0.01）。而阻断P2X7/PI3K/AKT信号后,长期镉暴露对成骨细胞和破骨细胞分化的抑制作用显著增强（p<0.01）。结果表明,P2X7/PI3K/AKT信号通路在镉抑制成骨细胞和破骨细胞分化的过程中发挥了重要作用。3.镉致小鼠骨质疏松发病机制的研究为了进一步验证镉对小鼠骨质疏松的影响,本试验建立小鼠镉中毒模型。用MicroCT、TRAP染色、ALP染色、组织学和Western blot等方法检测骨质疏松相关指标。结果显示,与对照组相比,短期（4个月）镉暴露后骨相关参数BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD和SMI均无显著性变化（p>0.05）,镉暴露未引起明显病理组织学变化,但骨组织中可见大量的破骨细胞,显著高于对照组（p<0.01）,成骨细胞数量显著减少（p<0.01）,骨组织中成骨关键蛋白和凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表达显著降低（p<0.01）。长期（15个月）镉暴露后,与对照组相比,骨相关参数:BV/TV、Tb.Th、Tb.N 和 BMD 显著降低（p<0.01）,而 Tb.Sp、SMI 值显著升高（p<0.01）;对照组骨组织未见明显病理变化,镉组骨组织染色均匀,局部可见大量成骨组织被软骨组织取代,未见明显炎症,骨髓中可见大量造血细胞及多核巨细胞;破骨细胞和成骨细胞数量显著低于对照组（p<0.01）;成骨和骨吸收关键蛋白的表达显著降低（p<0.01）,而凋亡蛋白的表达显著增加（p<0.01）。长期和短期镉暴露均显著抑制P2X7/PI3K/AKT信号相关蛋白表达（p<0.01）。总之,长期镉暴露小鼠表现出明显的骨质疏松,而短期暴露并未表现出骨质疏松症状。综上所述,①长期镉暴露可致小鼠发生明显的骨质疏松,短期暴露并未表现出骨质疏松症;②抑制成骨细胞和破骨细胞分化是长期镉暴露诱导骨质疏松的主要原因,促进破骨细胞活性是短期镉暴露致骨质疏松的早期表现;③短期镉暴露抑制成骨细胞和破骨细胞发生凋亡,细胞自噬在此过程扮演了保护作用,长期镉暴露促进骨组织凋亡;④P2X7受体敲减抑制了成骨细胞和破骨细胞的分化,过表达P2X7受体阻止了镉对成骨细胞和破骨细胞分化的抑制作用。