论文部分内容阅读
背景和目的:结直肠癌是全世界常见恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率都很高。结直肠癌的进展、复发和转移是导致病人预后不良和生存率差的主要因素。丝氨酸/精氨酸(Serine/arginine,SR)蛋白是一类富含S/R残基的剪接因子,在m RNA选择性剪接的调控过程中发挥重要作用。丝氨酸/精氨酸蛋白激酶1(Serine/arginine protein kinase1,SRPK1)是一种能够磷酸化SR蛋白的激酶,参与调控SR蛋白在细胞周期内定位以及翻译控制等RNA代谢。目前在人类许多癌症中发现SRPK1表达明显增高,但其在结直肠癌中的表达情况及分子机制仍少有报道。本研究首先在结直肠癌石蜡组织切片标本中探讨SRPK1的表达与结直肠癌临床病理特征及患者预后的关系,同时在新鲜结直肠癌组织及两种结直肠癌细胞株中检测SRPK1 m RNA和蛋白的表达。通过干扰SRPK1表达后检测结直肠癌细胞中SRPK1表达对结直肠癌细胞增殖、侵袭转移及肿瘤血管形成等恶性生物学行为的影响。方法:1.免疫组织化学技术检测85例结直肠癌患者术后石蜡组织切片标本中SRPK1蛋白的表达,初步分析其与临床病理特征的相关性,并随访患者生存资料,分析SRPK1表达对结直肠癌患者预后的影响;应用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测15例结直肠癌患者术后新鲜组织中SRPK1 m RNA和蛋白的表达。2.q RT-PCR和Western blot检测两株结直肠癌细胞(Caco2和HT-29)中SRPK1的表达。应用脂质体法分别将SRPK1 si RNA(1～4)和对照si RNA(si NC)分别转染入相应结直肠癌细胞株中,应用q RT-PCR和Western blot法检测筛选出最佳SRPK1si RNA。应用CCK8法、克隆形成实验检测各处理组中细胞增殖能力,Transwell小室实验检测各处理组中细胞迁移、侵袭能力。应用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术(FCM)检测各处理组中细胞凋亡能力。同时将过表达SRPK1质粒分别转染到两株结直肠癌细胞株中,应用Western blot法检测SRPK1蛋白的表达,并用CCK8法检测对细胞增殖能力的影响。3.应用脂质体法分别将SRPK1 si RNA和si NC转染入结直肠癌细胞HT-29 48h后提取细胞上清液,利用各处理组中细胞上清液与人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)共同培养。应用ELISA法检测转染后HT-29细胞上清中VEGF的表达,CCK8法检测各处理组中HUVEC增殖能力,划痕试验检测各处理组中HUVEC迁移能力,管腔形成实验检测各处理组中HUVEC管腔形成能力,应用Western blot检测各处理组中HUVEC内促血管生长因子Tie2和Ang2的蛋白表达。结果:1.免疫组化染色结果提示,SRPK1主要表达于结直肠癌细胞的细胞质和细胞膜。85例结直肠癌组织标本中有44例SRPK1蛋白高表达,高表达率为51.76%,SRPK1在正常结直肠组织中表达弱或无染色。q RT-PCR和Western blot结果提示,在15对新鲜的结直肠癌和癌旁正常组织中,SRPK1 m RNA和蛋白在癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。2.统计发现,结直肠癌TNMⅢ～Ⅳ期和淋巴结转移的患者SRPK1阳性表达水平显著高于Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移的患者(P<0.05)。而且,随着肿瘤浸润深度的进展,浸润深度穿透固有肌层及以上(T3+T4)的肿瘤中SRPK1表达也明显高于未穿透固有层肌(T1+T2)的肿瘤组织(P<0.05)。Kaplan-Meier分析显示SRPK1在结直肠癌的表达水平与患者生存率呈负相关(P=0.01)。单因素分析表明SRPK1、结直肠癌的TNM分期、浸润深度和是否发生淋巴结转移或远处转移这五个病理参数与结直肠癌患者术后生存期均有相关性(P<0.05);Cox比例危险模型对单变量分析中的这五个病理参数进行多变量分析显示SRPK1和TNM分期是结直肠癌预后的独立指标(P<0.05)。4.Caco2和HT-29癌细胞株中SRPK1 m RNA和蛋白表达明显高于正常肠黏膜上皮细胞NCM460(P<0.05)。选用抑制效果最佳的SRPK1 si RNA(si SRPK1)用于后续试验。抑制SRPK1表达后能明显抑制结直肠癌细胞增殖;相反,过表达SRPK1后,能显著促进肿瘤细胞增殖能力。下调SRPK1表达的两种结直肠癌细胞株都出现迁移和侵袭能力减弱,细胞凋亡明显增加(P<0.05)。5.ELISA检测发现转染SRPK1 si RNA后的HT-29细胞上清中VEGF的表达明显下降。与对照组相比,SRPK1表达下调后的HT-29细胞上清与人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)共培养后,HUVEC的增殖能力、迁移能力、新生血管能力均明显减弱。同时促血管生长因子Tie2和Ang2蛋白表达也明显降低。结论:1.结直肠癌组织中SRPK1表达与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关。SRPK1表达和TNM分期是结直肠癌患者生存的独立影响因素。2.SRPK1表达下调后可明显抑制结直肠癌细胞增殖,并促进凋亡,同时迁移及侵袭能力也明显减弱。3.SRPK1表达下调后显著减弱HUVEC增殖、迁移、管腔形成能力,抑制体外血管形成。