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背景邻苯二甲酸二脂(2-乙基己基)[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]是一种无色透明、有特殊气味的有机化合物,广泛应用于工农业生产中。人可通过饮食、呼吸、皮肤接触等多种方式摄入DEHP,DEHP进入机体后可产生一系列危害,并且其作用可随着DEHP在机体内部的不断蓄积而增强。当人体短期内吸收大量的DEHP后,可导致急性毒性反应。研究表明,DEHP对于人体健康的危害主要体现在急性毒性作用及对于各器官系统的慢性损伤。相对于一般人群,孕妇和胎儿对DEHP更加敏感。DEHP过度暴露可导致多种妊娠和胚胎发育的异常。目的本课题的目的是利用不同剂量DEHP作用于妊娠大鼠,分析DEHP暴露对胎盘组织结构和胚胎大鼠生长发育的影响,进一步利用基因芯片技术和分子生物学方法研究DEHP暴露对大鼠胎盘组织基因表达谱的影响,分析不同剂量DEHP暴露对胎盘组织结构的影响及其作用机制。方法60只妊娠Wistar大鼠随机分为4组,分别为对照组、DEHP低剂量组、DEHP中剂量组和DEHP高剂量组,每组15只,其中对照组给予玉米油灌胃,DEHP暴露组分别给予100 mg/kg(低剂量组)、500 mg/kg(中剂量组)和1000 mg/kg(高剂量组)的DEHP灌胃给药,从大鼠妊娠12 d起开始给药,每日1次,连续给药7d后处死动物。检测各组妊娠大鼠的胚胎发育和胎鼠情况,包括胎盘质量、存活胎数、畸形胚胎数量、胚胎大鼠的身长、尾长、体重及各个器官的重量,分析比较各组妊娠大鼠之间各项指标的差异;HE染色观察胎盘组织结构;收集各组大鼠新鲜胎盘组织,利用基因芯片检测各组妊娠大鼠胎盘组织基因表达谱的差异,进一步用real time RT-PCR及Western Blot方法对基因芯片检测结果中差异明显基因AKr7a3、ugt2b37、GSTA5、Sult2a1、Fmo1、Maob、Aldh1a3和cyp2f4进行m RNA和蛋白质水平的验证。结果1各组妊娠大鼠一般情况良好,摄食和饮水量无异常,动作行为正常;给DEHP处理前各组大鼠的体重无明显差异性,在给予DEHP处理期间,不同剂量的3组大鼠的体重增加速度均小于正常对照组(P<0.05);高剂量组大鼠体重增加速度低于中剂量组和低剂量组,而中剂量组的体重增加速度又低于低剂量组,体重变化值具有DEHP剂量依赖性(P<0.05)。2对照组孕鼠的胎盘形状为椭圆形、边缘薄中间厚、暗红色,胎盘的胎儿面覆盖有半透明状羊膜,羊膜表面光滑;低剂量DEHP处理组孕鼠的胎盘外观与对照组相比变化不明显;中剂量DEHP处理组孕鼠的胎盘色泽较灰暗,胎盘的重量和体积较对照组及低剂量DEHP处理组有所减轻,胎盘中间的厚度变薄;高剂量DEHP处理组孕鼠的胎盘变化更显著,显示出不同程度的淤血水肿,羊膜颜色发黄,透光性变的很差。通过HE染色结果可以看到,对照组孕鼠胎盘结构层次清楚,细胞形态规则,绒毛膜滋养细胞排列紧密整齐;低剂量DEHP处理组孕鼠的胎盘组织结构基本正常;中剂量DEHP处理组胎盘海绵滋养层(Sp)变薄,滋养细胞体积变小,迷路带中可见红细胞增多;高剂量DEHP处理组胎盘各层细胞的界限变得模糊,海绵滋养细胞层显著变薄,部分细胞的胞浆出现网状空泡状改变。3各组妊娠大鼠的胚胎数量及性别比例无显著差异,但中剂量DEHP处理组和高剂量DEHP处理组妊娠大鼠的活胎数明显低于对照组(P<0.05)。DEHP处理组胚胎的体重、身长及尾长均显著低于对照组(P<0.05);而且不同DEHP处剂量组之间的胚胎体重、身长和尾长也有明显差异,变化趋势呈现剂量依赖性(P<0.05)。各组胚胎大鼠的脏器系数比较结果显示,实验组胎鼠明显小于对照组(P<0.05)。4对各组妊娠大鼠胎盘组织进行基因芯片检测显示,AKr7a3、ugt2b37、GSTA5、Sult2a1、Fmo1、Maob、Aldh1a3和Cyp2f4基因的表达水平与DEHP浓度呈剂量相关性。5 real time RT-PCR结果显示,与对照组相比,DEHP处理组妊娠大鼠的胎盘组织中Sult2a1m RNA、Maob m RNA表达量随着DEHP浓度的增加而升高(P<0.05)。AKr7a3m RNA、ugt2b37 m RNA、GSTA5m RNA、Fmo1 m RNA、Aldh1a3m RNA、Cyp2f4 m RNA的表达量则随着DEHP浓度的增加而降低(P<0.05)。6 Western Blot结果显示,AKr7a3蛋白在各组之间差异不明显。该结果与real time RT-PCR分析结果不一致,AKr7a3蛋白与DEHP引起胚胎发育的毒性相关性还有待进一步研究。而Sult2a1蛋白、Maob蛋白的表达水平与DEHP的浓度呈剂量相关性,DEHP处理各组Sult2a1蛋白、Maob蛋白的表达水平均高于对照组(P<0.05)。其变化趋势呈浓度依赖性,即随着DEHP的浓度增高,Sult2a1蛋白、Maob蛋白的表达水平也相应增高。该结果与荧光定量PCR分析结果一致。结论DEHP暴露可引起胚胎大鼠生长发育迟缓和畸形;引起胎盘、淤血水肿、细胞凋亡等变化;基因表达谱分析显示DEHP暴露可导致大鼠胎盘组织多种基因表达改变;对部分基因进行m RNA和蛋白水平验证,发现AKr7a3、ugt2b37、GSTA5、Sult2a1、Fmo1、Maob、Aldh1a3和Cyp2f4基因的表达水平随着DEHP浓度增加而降低,Sult2a1、Maob基因表达水平随着DEHP浓度增加而升高。