地鳖虫属鳖蠊科昆虫,应用现代提取技术从地鳖中提取主要成分有蛋白质、多糖、多肽等。地鳖是一种重要的中药,研究表明,地鳖虫有效成分具有调节血脂、抗肿瘤、调节免疫、抗氧化等作用。目前,对地鳖有效成分作用机制缺乏深入研究,本研究拟采用酶解法提取制备地鳖多肽,通过体内外实验明确其清除自由基和抗氧化及抗衰老作用,采用RT-PCR和Western Blot等分子生物学技术分析地鳖多肽在Nrf2-ARE信号通路中的作用,目的阐明地鳖多肽抗氧化机制,为未来开发地鳖多肽抗氧化剂提供实验依据。①试验一地鳖多肽提取纯化及鉴定通过酶解法提取制备地鳖多肽,分别采用双缩脲法和Tricine-SDS-PAGE法分析地鳖多肽的浓度与分子量。结果提取的地鳖多肽的浓度为45mg/mL,分子量为8-9kDa左右小肽。②试验二地鳖多肽清除自由基的研究分别采用Fe2+-邻二氮菲法、邻苯三酚自氧化法和分光光度法测定地鳖多肽对自由基的清除、红细胞氧化溶血、肝脏线粒体肿胀及组织MDA生成的影响,分光光度法测定地鳖多肽的铁还原力、β-胡萝卜素-亚油酸氧化和亚油酸自氧化。结果与对照组比较,随着地鳖多肽浓度增加,地鳖多肽对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除率升高,红细胞溶血降低、线粒体肿胀程度降低及组织中MDA的生成抑制率升高,亚油酸和胡萝卜素氧化程度降低。结果表明,地鳖多肽具有抗氧化活性,能清除自由基、抑制MDA生成,降低自由基引起组织细胞损伤。③试验三地鳖多肽抗氧化作用的研究小鼠连续灌服不同剂量地鳖多肽20d,分别采用黄嘌呤氧化酶法、比色法和TBA法测定小鼠组织和血液、血清中SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA含量,组织称重计算脏器指数。结果与衰老组比较,地鳖多肽组小鼠组织和血液中SOD、CAT、GSH-PX的活力明显提高,组织中MDA含量显著降低。结果表明,地鳖多肽能提高小鼠体内抗氧化酶活力,降低组织中过氧化物生成,呈现明显抗氧化作用。④试验四地鳖多肽抗氧化衰老作用的研究小鼠腹腔注射D-半乳糖建立衰老模型,同时灌服不同剂量地鳖多肽连续20d,观察小鼠活动情况,组织称重计算脏器指数,测定小鼠运动和耐应激能力,通过黄嘌呤氧化酶法、比色法、TBA法和DNTB法测定小鼠SOD、CAT、GSH-PX活力、MDA和GSH含量。结果模型组小鼠采食量减少,运动能力和耐应激能力降低,组织和血液、血清中SOD、CAT、GSH-PX活力明显减弱、组织中MDA含量升高但GSH含量降低;地鳖多肽组小鼠运动能力和耐应激能力增强,小鼠体内SOD、CAT、GSH-PX活力提高,MDA含量降低但GSH含量增加。结果表明,地鳖多肽通过提高小鼠抗氧化能力,延缓氧化衰老。⑤试验五地鳖多肽在Nrf2-ARE信号通路中作用的研究首先用地鳖多肽和H2O2及tBHQ处理Caco-2细胞,然后分别采用DNTB法、荧光探针法及分光光度法检测细胞内GSH、ROS含量和HO-1活力,免疫荧光法和免疫组织化学法检测细胞核中Nrf2表达,Western Blot和RT-PCR法分析细胞内Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达水平,结果地鳖多肽组细胞内GSH含量升高而ROS含量降低、HO-1活力提高,细胞内Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达上调。结果揭示,地鳖多肽可能是通过启动Nrf2-ARE信号通路起到抗氧化作用,提示地鳖多肽的抗氧化作用机制。综上所述,酶解法提取得到8～9kDa大小的地鳖多肽,其具有体外清除自由基,提高机体体内抗氧化酶及降低组织中过氧化物生成的作用,呈现良好抗氧化和延缓氧化衰老功能;上调细胞内Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达,提高细胞内GSH含量和HO-1活力等,结果提示地鳖多肽可能通过启动Nrf2-ARE信号通路呈现抗氧化作用。