豫选黄河鲤(Cyprinus carpio haematopterus)是由河南省水产科学研究院采用野生黄河鲤做亲本,经过近20年、连续8代精心繁育而成。迄今已得到广泛推广,有着显著的经济和社会效益。然而,近几年,黄河鲤各类疾病的频发,使黄河鲤养殖风险大大增大,造成严重的经济损失,明显制约了该产业的可持续健康发展。感染锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)的黄河鲤具高度传染性和极高的致死率。直到目前仍没有好的防御措施和治愈手段。因而了解黄河鲤自身免疫系统对这种病毒的防御功能和培育抗病的优良品种显得尤为重要,也是维持健康水产养殖业的关键所在。先天免疫识别受体及信号通路相关基因在病毒检测、干扰素诱导、保护机体免受侵害等方面具有关键作用。LGP2作为RIG-I样模式识别受体的家族成员之一,首先识别存在于细胞质中的病毒DNA或RNA,随后下游系列信号级联反应被激活,诱导产生I型干扰素和促炎性因子。干扰素基因的刺激基因STING是宿主细胞中DNA病毒识别的感知器,通过RIG-TBK1-IRF3/IRF7信号级联来诱导产生干扰素,对DNA病原体做出先天免疫反应。为研究上述免疫相关基因的分子特性和抗病毒机制,本研究通过基因克隆及病毒感染,鉴定和分析了LGP2、STING基因和KHV病毒体内外感染后基因表达谱以及poly(I:C)和poly(d A:d T)配体刺激CFC(尾鳍细胞)后的基因表达情况,探究LGP2和STING在病毒识别及抗病毒级联反应中的作用。为进一步探究LGP2和STING基因与抗KHV的关联性及遗传特性,本研究提取感染KHV病毒的黄河鲤脾脏的DNA,利用特异PCR和染色体步移技术获得LGP2和STING基因全长及5’侧翼序列,并应用生物信息学和生物统计软件SPSS等工具对克隆所得目标基因的结构特征及遗传信息进行系统的比较分析;通过构建表达载体,验证启动子活性;以及利用基因池混合测序和PCR-RFLP方法,对目的基因的核苷酸多态位点与黄河鲤抗KHV感染进行关联分析,并对其表型关联位点进行验证。1.黄河鲤LGP2基因存在两个选择性剪接体,LGP2a c DNA全长为3061bp,ORF开放阅读框位于第127位到第2066位核苷酸,编码680个氨基酸的多肽,预测分子量为77,341.2Da,等电点为6.53。预测四个蛋白质结构域,包括细菌III型限制性内切酶的保守结构域,DEAD/DEAH盒解旋酶结构域,C末端解旋酶超家族结构域和调节结构域。LGP2b的全长为1928bp,编码346个氨基酸,5’-非翻译区(UTR)为114个核苷酸,3’UTR有603个核苷酸,其中包括AATAA终止信号。黄河鲤LGP2基因全长DNA为7655bp,有12个外显子,11个内含子,所有内含子均是由GT开头,AG结尾的,在LGP2 DNA全长与LGP2a和LGP2b m RNA比对结果显示,LGP2a和LGP2b来源于同一条DNA序列,在第七外显子处m RNA序列出现不同的选择性剪切,将第七内含子的部分序列转录为第七外显子,形成一条完整的m RNA序列。LGP2的5’侧翼序列预测有两个启动子,并且其活性均能被KHV诱导加强。病毒感染实验结果表明,LGP2有助于ds DNA病毒介导的细胞先天免疫应答的正调节。2.LGP2的16个有效的多态位点被探测到:其中包括12个SNP位点、4个有缺失核苷酸的位点;其中5’侧翼区的-294GCT三核苷酸缺失和414 GT二核苷酸缺失位点以及内含子中的3820 T/C和3836T/G位点的基因型和等位基因频率在抗性组和易感组间差异显著。经二次感染验证表明,-294 ins、414 ins、3820TT,3836TT基因型的黄河鲤分别比-294 del、414del,3820CC,3836GG型的黄河鲤死亡率低。因此该四个位点的突变可能是黄河鲤疱疹病毒病的遗传相关的危险因素。3.STING c DNA全长1528bp,编码402个氨基酸的多肽,分子量为46.184k Da,等电子点为6.08。推测的STING蛋白含有信号肽,N-末端区域中的三个跨膜基序和驻留的内质网蛋白中发现存在四个假定基序(RXR)。STING基因DNA全长为8068bp,由7个外显子和6个内含子组成,所有内含子均遵循GT开头,AG结尾的规律。5’-侧翼序列为901bp,序列预测有启动子活性,其活性可被KHV诱导加强。STING被鉴定为由DNA病原体介导的黄河鲤先天免疫应答的组成部分,并且在体外和体内都证实了STING对下游反应的正向调节中起关键作用。4.STING的14个有效的多态位点被探测到:13个SNP位点、1个有缺失核苷酸的位点;其中5’侧翼区的-873G/C和-687CCT三核苷酸缺失位点;外显子中的6767G/A和7034C/T位点的基因型和等位基因频率在抗性组和易感组间差异显著。二次病毒刺激实验表明,STING基因的-873GG、-687ins、6767GG和7034CC基因型的黄河鲤分别比-873CC、-687del、6767TT和7034TT型的黄河鲤死亡率低(P<0.05),可以认为-873G/C、-687ins/del、6767G/A和7034C/T与黄河鲤抗KHV感染抗性-易感表型显著相关,可以作为抗病育种的分子标记。5.为了研究黄河鲤对KHV病毒的抗病防御机制和抗KHV的关联性,本研究将KHV病毒感染后黄河鲤抗性组和易感组的鳃和脾脏的RNA进行转录组测序,4个组织转录组测序共获得1.90亿个Raw reads,过滤后得到1.35亿Clean reads,经Trinity软件组装后,得到469,251个transcripts和366,783个unigene,unigene平均长度667,最长为18437bp,最短为201bp。其中长度在200-600 bp的序列有347659条,占74.08%。比对到Nr数据库的序列有31,837条,且与斑马鱼一致性最高,其次是墨西哥丽脂鲤和虹鳟,说明与鲤科鱼类的基因一致性最高。采用R with edge R package筛选差异表达基因,并对差异基因进行GO富集和KEGG通路富集分析,脾脏和鳃的抗性和易感组的差异基因数量相似,从天然免疫识别受体途径中选出78个基因在抗性组和易感组之间的表达差异表明,鱼类在脾中和鳃中抗KHV病毒的反应是不同的。本研究还对转录组文库中的基因进行SNP、SSR和选择性剪切进行概况分析。无论是鳃还是脾抗病组的SNP位点少于易感组;编码区SNP位点少于非编码区,但脾脏中编码区突变多于非编码区;每个组织转录组中,有意突变占总SNP的43.1%-50.58%,而无意突变仅占0.11%-0.13%。文库中由C转换为T的SNP最多,其次是由T转换为C,最少的是由C转换为G。本数据库中从检测序列168,510条中检测出31,084条存在SSR,而包含SSR的序列数为25,240,约占总检测序列数的15%,包含多于一个SSR的序列为4,549条,占所有SSR序列的18%;不同碱基SSR为1,401,含一个以上SSR的序列约占30.8%。重复的最大和最小长度分别为119和18,平均长度为24个核苷酸。SSR的模序类型主要以单核苷酸9-12重复最多,而4核苷酸及5核苷酸5-8重复最少。在本研究中,经transcripts与unigenes比对,共有16,491个unigenes含有多个转录本(29.88%),可能受选择性剪切调节。这些unigenes中,某些不同表达转录本的基因DET共4,183占总Unigene的7.58%。本实验结果提供易感组鳃和脾脏以及抗病组鳃和脾脏的转录组概况,为黄河鲤抗疱疹病毒病的免疫生物学的第一次评估、也为后续的抗病分子育种奠定了理论基础。