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鲎素Ⅰ(TachyplesinsⅠ,TP-Ⅰ)是存在于东方鲎血细胞中的由17个氨基酸组成的小分子阳离子抗菌肽,结构内含2个二硫键,其二级结构为2个逆向平行的β-折叠通过1个β-转角结构连接。TP-Ⅰ具有强烈的抑杀细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞等多种生物活性,被公认为是抗生素潜在替代药物,在医药、畜牧、食品添加剂以及培育农作物新品种等领域均有广阔的应用前景,但由于其获得途径受限制,导致目前并没有规模化TP-Ⅰ商业产品出现。为解决此类问题,本课题以串联TP-I基因为目的基因,利用基因工程技术构建高效表达TP-I的毕赤酵母(Pastoris pichia)真核表达体系,并且对表达产物进行各方面分析。首先,根据文献中已报道的TP-I肽氨基酸序列,分析TP-I多肽结构与其抑杀菌活性的关系、毕赤酵母菌对TP-I多肽的耐受情况等,选择具有17个氨基酸序列的TP-I肽作为目标序列。为实现选择的TP-I抗菌肽在工程菌中的高效表达,设计利用胰肽酶E的特异酶切位点-Ala↓或-Gly↓和羧肽酶A特异性酶切位点(序列C末端氨基酸),连接选定的4肽构成4拷贝串联74肽,根据毕赤酵母菌重组表达偏爱密码子原则,合成重组TP-I肽基因序列,克隆至高效表达载体pGAPZαB上,通过双酶切、PCR以及测序分析,表明成功构建了重组表达载体pGAPZαB-4TP-I。然后,将构建的表达载体pGAPZαB-4TP-I通过电转化方法,转化至宿主毕赤酵母菌GS115中,无需诱导,经YPD培养基摇瓶发酵后,利用Tri-SDS-PAGE电泳技术检测发酵液中产物情况,结果表明构建的4TP-I多肽序列能够在宿主菌中表达。将发酵液经Ni亲和层析柱的吸附与洗脱,洗脱液通过超滤离心管的离心浓宿、胰肽酶E和羧肽酶A酶的酶解等操作,再次进行Tri-SDS-PAGE电泳检测分析,显示在3.3 kDa附近存在与化学法合成的TP-I条带一致的蛋白质条带,证明酶切位点设计的正确。最后,酶解所得TP-I单体经BCA法和RP-HPLC法测定,1 L摇瓶发酵液中TP-I产物含量为27.24~29.53 mg,分别以大肠杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌,对TP-I单体产物进行抑菌检测,结果显示TP-I单体具有不同程度的抑杀菌活性;另将TP-I单体产物委托公司做高分辨飞行时间质谱分析,得到分子量为2262.85,与设计的17个氨基酸序列分子量大小一致。因此,说明TP-I在毕赤酵母菌GS115表达体系的高效表达具有可行性。