牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是一种与牛的胃肠道、呼吸道和生殖系统疾病相关的重要病原体,给我国养牛业造成严重的经济损失。目前,疫苗免疫仍是防控该病最有效的方法。因此,本研究应用临床分离的流行毒株BVDV1型JL3株制备灭活疫苗,并对其免疫原性进行研究,为疫苗的进一步研制奠定基础。为了解牛病毒性腹泻病毒的流行情况,本研究建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型和2型的Taq Man双重实时荧光定量PCR方法,并应用该检测方法对采自吉林省部分牛场的临床样品进行检测。结果表明,建立的双重实时荧光定量PCR检测方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.3μmol/L。该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,检测下限均为10~1拷贝/μL。临床样品检测结果显示,156份样品中共检测出BVDV阳性样品36份,总阳性率为23.1%,其中BVDV1型阳性率为17.9%（28/156）,BVDV2型阳性率为5.1%（8/156）,表明BVDV1型的感染率较高。为制备BVDV1型JL3株灭活疫苗,首先通过优化病毒接种方式、感染复数及接种时间,确定病毒适宜增殖条件;通过优化灭活剂（BEI）的使用浓度和灭活时间确定病毒适宜灭活条件;选择不同佐剂制备BVDV JL3株灭活疫苗,并进行物理性状、无菌及安全性检验。结果表明,病毒的适宜增殖条件为:单层接毒、MOI=0.05以及接种92 h后收毒。病毒的适宜灭活条件为:BEI终浓度为3 m M,灭活时间为18～24 h。应用ISA201佐剂、ISA206佐剂和IMS1313佐剂分别制备BVDV灭活疫苗,疫苗无菌、稳定性、黏度、剂型和安全性检验均符合制苗要求。为评价不同佐剂所制备的BVDV JL3株灭活疫苗的免疫原性,将三种佐剂制备的灭活疫苗与商品化对照疫苗同时免疫小鼠,通过ELISA和流式细胞术等方法对免疫后小鼠的中和抗体效价、淋巴细胞增殖、T淋巴细胞亚群含量及细胞因子IL-4和IFN-γ的表达水平进行检测,并通过攻毒试验检测疫苗的免疫保护效果。结果表明,各疫苗组首免后21 d均可检测到中和抗体,至首免后35 d中和抗体达到峰值;小鼠首免后35 d使用Con A刺激脾淋巴细胞,各疫苗组SI指数均明显高于阴性对照组（P＜0.01）;三种佐剂疫苗组和商品化疫苗组CD4+T淋巴细胞亚群含量及CD8+T淋巴细胞亚群含量均明显高于阴性对照组（P＜0.01）;各疫苗免疫组IL-4和IFN-γ水平均明显高于阴性对照组（P＜0.01或P＜0.05）。小鼠免疫攻毒试验结果表明,三种佐剂制备的灭活疫苗免疫小鼠后对强毒攻击均可产生较好的保护效果,均可有效降低小鼠各脏器的病毒载量,降低病毒对十二指肠的病理损伤,其中ISA206佐剂和IMS1313佐剂疫苗免疫保护效果优于ISA201佐剂疫苗和商品化疫苗。综上所述,本研究对BVDV的临床诊断、流行病学调查及净化提供有效的技术手段,同时为BVDV疫苗的进一步研究奠定基础。