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高渗透压甘油促有丝分裂原活化蛋白激酶信号传导途径(High osmolarity glycerol mitogen-activted protein kinase signaling transduction pathway,HOG-MAPK)是酵母细胞调控外界高渗透压胁迫应答的主要途径,在真核生物的高渗透压胁迫、氧化胁迫、柠檬酸胁迫、热休克及低温胁迫的应答调节中也具有重要作用,但目前仍未见HOG-MAPK途径与真菌多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的低温合成有关的研究报道。我们前期的研究发现,在产油酵母一红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235菌株中,培养温度的降低能引起细胞膜脂中PUFA含量的显著增加,而且抑制PUFA合成能影响该菌株的低温生长特性,PUFA可能与YM25235菌株的低温生长适应性有关。因此,本研究拟从YM25235菌株克隆HOG-MAPK途径的关键基因Rkhog1,进一步研究其对红冬孢酵母YM25235菌株低温生长适应性和低温条件下PUFA合成的影响,揭示红冬孢酵母YM25235菌株低温下PUFA合成与HOG-MAPK途径的关系。首先对低温条件下YM25235中Rkhog1基因的mRNA转录水平、蛋白磷酸化水平和细胞内的甘油含量进行分析。结果发现在15℃条件下培养1 h时,Rkhog1基因的mRNA转录水平明显高于对照菌株,Rkhog1蛋白磷酸化水平也明显升高,且YM25235细胞内甘油合成量也相应增加。这些结果表明,低温会引起Rkhog1基因mRNA转录水平、蛋白磷酸化水平的提高及细胞内甘油含量的增加,Rkhog1基因可能与YM25235菌株的低温生长适应性有关。其次,对Rkhog1基因进行克隆、序列分析及功能验证。根据YM25235转录组测序结果设计特异性引物,以cDNA为模板PCR扩增得到全长1080 bp的一个cDNA序列Rkhog1,编码365个氨基酸,所编码的蛋白大小为40.8 kD,理论等电点为5.33。序列分析结果显示,Rkhog1基因编码的氨基酸序列中含有Hog1蛋白保守的结构功能域:蛋白激酶ATP结合区域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶位点、“CD”基序及高度保守的磷酸位点“TGY”三肽基,且相似性搜索表明Rkhog1基因编码的氨基酸序列与来源于禾本红酵母(Rhodotorula graminis)Hog1的氨基酸序列相同性最高,为97.8%,与白色念珠菌(Candida albicans)Hog1的相同性为71.1%,与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Hog1的相同性为64.8%,表明我们扩增得到了一个潜在的hog1基因。为了验证获得的Rkhog1的功能,将该序列插入pWXY3.0中构建重组表达载体pW3Rkhog1,进一步转化酿酒酵母hog1Δ菌株中诱导表达,分析该基因与盐胁迫、高渗透压胁迫及低温胁迫的关系。分析结果显示,与酿酒酵母Schog1基因回补酿酒酵母hog1Δ菌株获得的分析结果一致,Rkhog1基因同样可以弥补酿酒酵母hog1Δ菌株中Schog1基因缺失带来的影响,能够恢复转基因菌株中甘油的合成以及盐胁迫、高渗透压胁迫及低温胁迫的耐受性。这些结果表明,从YM25235菌株中克隆的Rkhog1是一个有功能的hog1基因。最后对Rkhog1基因与YM25235菌株中PUFA低温合成之间的关系进行分析。将Rkhog1基因插入表达载体pRH2304中,构建重组表达载体pRHRkhog1,将其转化YM2535菌株中进行过表达。胁迫抗性分析结果表明,Rkhog1基因过表达同样促进了 YM25235菌株中的甘油合成量,还明显提高了 YM25235菌株对盐胁迫、高渗透压胁迫和低温胁迫的耐受性的影响。脂肪酸分析结果显示,与对照相比,Rkhog1基因过表达导致15条件下YM25235菌株中亚油酸(linoleic acid,LA)和亚麻酸(linoleinic acid,ALA)含量从 28.16%和 8.87%增加到 36.76%和21.11%,分别增加了 1.30倍和2.38倍,油酸的含量明显减少;但是30℃条件下无明显变化。进一步分析结果还显示,Rkhog1基因过表达促进了 15℃条件下催化油酸(oleic acid,OA)转化为LA和ALA的A12/15-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA转录水平提高了 3.58倍,而30℃条件下基本没有变化。这些结果表明低温条件下Rkhog1基因可提高转基因菌株的RKD12的mRNA转录水平,从而增加了 PUFA的合成量,进而提高了菌株的低温适应性。此外,分析还显示,15低温条件下转录因子Msn4基因mRNA转录水平也增加,Rkhog1基因过表达使这种增加更加明显,然而30℃条件下同样无明显变化,说明低温条件下Rkhog1基因表达能促进Msn4基因转录,而且转录因子Msn4还可能与YM25235菌株PUFA的低温合成有关。综上所述,通过本研究获得一个HOG-MAPK途径中的关键基因Rkhog1基因,通过功能分析表明,其能促进酿酒酵母的盐胁迫、渗透压胁迫和低温胁迫耐受性,在YM25235菌株中过表达分析也证明了这一点,而且本研究还表明Rkhog1基因与低温条件下RKD12基因mRNA转录水平和PUFA合成水平增加有关,从而有助于YM25235菌株的低温生长适应性。本研究结果有助于阐明产油酵母-红冬孢酵母YM25235中PUFA低温合成的信号传导途径及合成调节机制,为揭示微生物低温适应性的机制提供参考,将有助于通过基因工程手段对其进行改造来提高不饱和脂肪酸LA和ALA的含量,为大规模商业化生产PUFA奠定基础。