论文部分内容阅读
研究背景及目的:乳腺癌是世界范围内女性发病率和死亡率最高的肿瘤,且发病率与死亡率仍保持逐年上升的趋势。肿瘤的侵袭转移是影响患者预后及导致死亡的重要原因,因此寻找乳腺癌转移特异性标志物,探索乳腺癌侵袭转移的分子生物学机制,可对乳腺癌生存预后及诊断治疗提供一定评估价值。TP53I11又名PIG11(P53-induced gene 11),最初是在研究P53介导的结肠癌凋亡通路中鉴定出的可被P53高表达激活靶基因之一,也是从肝癌细胞染色体11p11.2区分离出的抑癌基因。研究发现,TP53I11主要在上皮来源组织如肝、胃肠、乳腺等及鳞状上皮组织表达且在对应肿瘤组织中低表达或缺失,可能与肿瘤的增殖及侵袭相关,但目前TP53I11在乳腺癌中发挥的生物学作用尚不清楚。本课题以包括210例乳腺癌组织芯片为研究对象,采用免疫组化方法检测并分析TP53I11基因在乳腺癌组织中表达情况与乳腺癌患者临床病理特征及生存预后的相关关系,通过在乳腺癌细胞株中过表达和敲除TP53I11基因方法初步探讨TP53I11基因在乳腺癌细胞增殖和迁移转移功能中发挥的作用,并对其可能发挥作用的途径进行了初步试探。方法:1.应用免疫组化方法检测210例女性乳腺癌组织芯片TP53I11的表达情况并探究TP53I11表达与临床病理特征相关性及与预后的关联性。2.利用PCDH-cmv-mcs-ef1-puro-flag构建过表达质粒,在MDA-MB-231及BT549乳腺癌细胞系中过表达TP53I11,用Western Blot和qRT-PCR方法证实TP53I11过表达细胞株构建成功;利用活细胞实时成像系统Incucyte、细胞划痕实验及Transwell空穿实验检测乳腺癌细胞增殖、迁移及转移能力。同时利用Crispr/cas9系统在MDA-MB-468细胞系中沉默TP53I11的表达并验证功能实验结果。3.Western Blot检测Vimentin和MMP9蛋白水平的相应变化,检测NF-κB通路关键蛋白的变化。4.统计学分析:应用SPSS17.0统计软件,计量资料采用(x±S)表示,运用t检验、卡方检验、Kaplan-Meier生存分析、Cox风险回归分析等统计方法,以α=0.05作为检验水准,P<0.05即表示差异有统计学意义。结果:1.免疫组化检测乳腺癌组织TP53I11表达并分析与临床病理特征及乳腺癌患者生存的相关关系,发现TP53I11表达与雌激素受体(Estrogen receptor,ER)(p=0.003)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)(p=0.004)状态及分子分型(p=0.004)相关,差异有统计学意义。Kaplan-Meier生存曲线分析发现,与TP53I11低表达患者相比较,TP53I11高表达的患者有更长的无病生存期(Disease-free survival,DFS)和总生存期(Overall survival,OS),Cox单因素和多因素风险比例回归模型分析表明TP53I11可作为乳腺癌患者独立预测DFS的指标。2.在MDA-MB-231及BT549细胞系中过表达TP53I11后,乳腺癌细胞的增殖和迁移转移能力被抑制,在MDA-MB-468细胞系中敲除TP53I11表达,相应肿瘤生物学功能增强。3.TP53I11的过表达能够使Vimentin、MMP9、NF-κB p65及NF-κB靶基因CXCR4的表达下调,敲除TP53I11后,这些蛋白表达水平上调。结论:TP53I11可作为独立预测乳腺癌患者无病生存期(DFS)的指标,TP53I11可抑制乳腺癌细胞增殖和迁移转移能力,有可能是通过影响Vimentin、MMP9的表达,参与NF-κB通路调控CXCR4的表达来发挥在乳腺癌细胞中的抑癌功能。