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伴随着社会和经济的发展,能源和资源面临耗竭的威胁,而木质纤维素具有在地球上分布广泛,储备丰富,可再生等特点,因此,如何将木质纤维素高值化利用引起广泛关注。纳米纤维素由于其独特的理化性质例如高比表面积、丰富的表面活性羟基、无毒、可再生等特点而用途广泛。传统的常用于制备纤维素纳米晶（Cellulosenanocrystals,CNCs）的方法是采用浓酸水解纤维素原料,存在化学品难回收、废液污染严重、纳米纤维素表面被改性等问题,而酶法制备CNC不仅能解决上述问题,而且水解液中的糖还可被进一步利用,制备生物乙醇等燃料和化学品。酶法制备CNC的关键在于需要利用合理酶系的纤维素酶对纤维素原料进行针对性的高效降解,而现有的商品纤维素酶并不适合CNC制备工艺对酶系的要求,致使酶法制备的效率较低。本论文针对这一现状,开展了 CNC制备用纤维素酶系优化及其应用的研究,以期待通过基因工程改造获得适合不同原料制备CNC的相关纤维素酶系,并以微晶纤维素MCC、桉木溶解浆和松木硫酸盐浆等为原料,评价了相关酶系的应用,并对CNC联产乙醇的可能性进行了初步探索。本论文主要研究结果如下:1.不同纤维素内切酶对以MCC为原料制备CNC的影响及相互作用研究对不同来源不同家族的内切纤维素酶在毕赤酵母GS115中进行异源表达,研究了含重组酶粗酶液的酶学性质。分离纯化获得不同内切纤维素酶组分,比较了不同家族重组内切纤维素酶水解MCC制备CNC的效果,发现单酶水解时GH12家族的内切纤维素酶制备CNC的得率最高,推测与GH12家族酶分子量低且不含CBM1有关,这些特点使得酶有利于渗入纤维素链内部,高效酶解纤维素无定形区。从多酶组合的效果来看,不同EGs在制备CNC时存在协同作用,较佳的内切纤维素酶组合为PoCel7B和PoCel5B的组合,以及TrCel5A和TrCel45A的组合。经SEM,XRD,TG等方法研究了不同纤维素内切酶及酶组合制备的CNC的特征,发现内切纤维素酶水解MCC制备的CNC产品为梭形,与原料相比,结晶度和稳定性得到提升。该研究对后续酶源选择和酶系优化提供了理论参考。2.适合纳米纤维素制备用草酸青霉纤维素酶系优化及其应用研究研究发现,在上述优化出的草酸青霉（Penicillium oxalicum）来源的Cel5B和Cel7B的混合内切纤维酶液中添加里氏木霉来源的Swollenin（SWO1）、以及草酸青霉来源的Swollenin（SWO4）能显著提升内切纤维素酶水解MCC制备CNC的得率,尤其是里氏木霉的SWO1。添加适量的草酸青霉CBH也有利于提高CNC产率,但较低和较高的CBH添加量都不利于CNC得率的提高。在上述研究基础上,以草酸青霉M12为出发菌株,通过基因工程技术,通过敲除菌株产量较高的CBH,同时表达Cel5B和/或Cel7B,经过PCR验证和发酵产酶验证,获得了可生产不同纤维素酶系的工程菌株。通过比较不同改造程度的菌株所产酶系对制备纳米纤维素的影响,以CNC得率和葡萄糖得率为评价指标,并参考CNC粒径分布、SEM观察、XRD和热重分析的研究结果,发现敲除CBH同时过表达草酸青霉来源的Cel5B和Cel7B以及里氏木霉来源的辅助蛋白SWO1的工程菌株cEES所产纤维素酶系,对利用MCC为原料酶法制备CNC具有良好的效果,CNC的得率较高、粒径尺寸小且大小分布均一、结晶度较高。3.以纸浆为原料制备纳米纤维素的研究在以微晶纤维素为底物优化纤维素酶系研究的基础上,研究了将工程菌株cEES的纤维素酶系应用于纸浆为原料制备CNC的应用效果。研究发现,通过增加cEES纤维素酶用量或在酶液中添加木聚糖酶,可以提高以桉木溶解浆为原料制备CNC的产品得率,同时减少产物中不规则纳米颗粒的数量。通过对比cEES酶系水解桉木溶解浆（Eucalyptus dissolving pulp,EDP）与松木硫酸盐浆（Pine kraft pulp,PKP）制备CNC的结果,发现以EDP为原料制备CNC的产品得率和CNC的结晶度都相对更高,这与PKP的化学组分及其性质更为复杂、纸浆纤维素结晶度相对较低等因素有关。在酶解过程中,随着水解时间的延长和无定形区纤维素的水解,纤维素底物结晶度增加,对纤维素酶解的抗性增强,导致水解后产生的CNC得率和水解液中葡萄糖产量下降,CNC的粒径大小相对均一。在分段水解法制备CNC工艺中,通过对后续酶解段纤维素残渣的简单机械处理,可以促进纤维素酶对底物的水解效率,提高CNC的产率和纤维素转化率,提高水解液中葡萄糖浓度。以溶解浆和硫酸盐浆制备的CNC形态多数为短棒状,具有比纸浆原料高的结晶度和热稳定性。4.以松木硫酸盐浆为原料制备CNC联产乙醇的研究在分析松木硫酸盐浆（Pine kraft pulp,PKP）化学组成特征的基础上,针对原料中含有较多木聚糖和甘露聚糖的特点,进一步在工程菌cEES中表达木聚糖酶和甘露聚糖酶,同时敲除了影响纤维素酶分泌的调控因子CreA,成功构建工程菌株cEES-XM。粗酶液的SDS-PAGE和蛋白浓度分析发现,与cEES相比,工程菌cEES-XM的胞外蛋白分泌能力提高,粗酶液中不同纤维素酶活力和半纤维素酶活力有明显提高。将工程菌cEES-XM的纤维素酶系在高纤维素底物浓度下水解松木硫酸盐浆,进行制备CNC联产纤维素乙醇的研究。通过评价CNC得率、水解液中葡萄糖浓度和乙醇浓度变化等指标,证明了 CNC联产乙醇技术的可行性。同时发现,高的纤维素底物浓度限制了 CNC得率,但通过添加LPMO,可以促进酶解反应的进程,提高CNC得率同时减少CNC粒径。SEM,XRD,TG等分析发现,以PKP为原料制备的CNC产物为棒状,具有较高的热稳定性和纤维素结晶度。对利用酶法生产的CNC进一步制备抗菌材料CNC-Ag的可行性进行了探索,紫外-可见光谱分析发现,在422 nm和427 nm有特征吸收峰,随着CNC-Ag浓度增高,峰值出现迁移。